Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4信号通路阻断癫痫大鼠海马神经元铁死亡机制及草果知母汤的干预效应

梁韡斌，张高炼，郭建辉，曾 敬，李 敏，陈 锐，张晓宁，刘姗姗

癫痫作为一种常见的脑部功能障碍疾病，其在我国总体发病率高达0.7%，且1年内癫痫病人发作率为0.45%[1-2]，然而由于癫痫的发病机制复杂多样，临床上对于癫痫的治疗药物有限且有效率低，所以加速抗癫痫药物研发对于改善癫痫病人生活质量具有重要意义。近年来，研究发现癫痫导致的认知功能障碍与Kelch-样ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路介导的海马神经元细胞铁死亡机制关系密切，且通过调节Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路蛋白进而抑制海马神经元细胞死亡成为癫痫治疗的新方法[3-4]。草果知母汤作为一种中药成方制剂，其以中医理论为指导，具有燥湿清热之功效，现代医学研究发现其对癫痫具有显著的改善作用[5]。本实验通过研究草果知母汤对癫痫大鼠的改善作用及对Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路的调节作用，为草果知母汤的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级6周龄雄性Wistar大鼠60只，体质量180～200 g，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK桂2009-0002，实验动物使用许可证：SYKG桂2009-2005。本实验遵守了广西中医药大学实验动物管理与保护的有关准则。

1.1.2 主要试剂 中药草果知母汤(草果10 g，知母10 g，厚朴10 g，半夏10 g，黄芩10 g，甘草10 g，由广西中医药大学第一附属医院研制，批号：20150108，制备方法：将中药饮片加水回流提取2次，第1次加10倍水提取2 h，第2次加8倍水提取1.5 h，药液过滤、合并浓缩至含生药浓度1 g/mL)。戊四氮(PTZ)购于美国Sigma公司(货号10106150)；丙戊酸钠(批号201806121，赛诺菲制药有限公司生产)；GPX4兔多克隆抗体(货号AF7020)、Keap1兔多克隆抗体(货号AF7335)、HO-1兔单克隆抗体(货号AF1333)、Nrf2(货号AF7623)兔多克隆抗体均购自碧云天生物科技公司；电化学发光(ECL)Plus超敏发光液(货号PE0010)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号G1120)、尼氏(Nissl)染色液(货号G1434)、总RNA提取试剂盒(货号R1200)、cDNA逆转录试剂盒(货号T2240)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号A0208)购自北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽(GSH)(货号ARB10949)及活性氧(ROS)(货号ARB14150)检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；铁含量检测试剂盒(货号MBC4350)购自北京麦瑞博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立 将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、草果知母汤低、中、高剂量组和西药对照组，每组10只。参照文献[6]方法腹腔注射PTZ 40 mg/kg，隔日1次，连续1个月，造模期间每次注射完毕后观察1 h，并按照大鼠生理反应及表现进行Racine分级，连续3次出现全面性强直-阵挛发作即判定造模成功，此后PTZ给药由隔日1次改为每3 d 1次，以维持造模状态。依据临床给药剂量，按照体表面积进行折算，草果知母汤低、中、高剂量组分别给予草果知母汤1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg灌胃；西药对照组给予腹腔注射丙戊酸钠(200 mg/kg)[7]，每日1次；模型组及正常对照组给予腹腔注射生理盐水，连续给药5周。

1.2.2 Racine评分 末次给药24 h后对大鼠进行Racine评分，0分：无抽搐发作；1分：耳、面部抽搐；2分：肌阵挛，但无直立位；3分：肌阵挛，伴直立位；4分：全面性强直-阵挛发作；5分：全面性强直-阵挛发作，并失去体位控制。

1.2.3 海马组织GSH、ROS水平及铁含量检测 取大鼠海马组织裂解匀浆，4 ℃，8 000 r/min，离心10 min，取上清，使用GSH、ROS水平及铁含量检测试剂盒测定GSH、ROS水平及铁含量。

1.2.4 HE及Nissl染色病理学观察 取大鼠海马组织于中性甲醛中固定后石蜡包埋，4 μm切片，采用HE及Nissl染色试剂盒进行常规HE及Nissl染色，观察大鼠海马CA1区病理学改变，并根据Nissl染色结果对海马CA1区进行神经元细胞计数。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(RTq-PCR)检测海马组织Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 取大鼠海马组织，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，根据Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1及GAPDH引物序列进行RTq-PCR反应，结果以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算海马组织Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1相对表达量。各基因引物序列见表1。

表1 各基因聚合酶链式反应(PCR)引物序列

1.2.6 免疫组化法 取海马组织切片，脱蜡水化后用30%过氧化氢(H2O2)孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3 min。将切片在10%的山羊血清中室温孵育20 min，以阻断非特异性结合，分别与GPX4、Nrf2兔抗体在室温下孵育1 h，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次，用二抗室温孵育30 min，切片经DAB染色、苏木素复染、脱水、干燥后光镜观察，用Image-Pro Plus 6.0计算蛋白表达积分光密度(IOD)值。

1.2.7 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) 用组织裂解缓冲液提取大鼠海马组织总蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。从每个样品中取50 μg蛋白，并将其电转移到硝酸纤维素膜上。用10%脱脂奶粉室温封闭1 h。然后用Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1和GAPDH抗体(1∶500稀释)在4 ℃孵育过夜，次日在洗涤液中冲洗3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀释)室温孵育1 h，再次洗涤后滴加化学发光液，在凝胶成像系统中成像并使用Image J软件定量分析蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 草果知母汤可降低癫痫大鼠Racine评分 与正常对照组比较，模型组大鼠Racine评分升高(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组Racine评分降低(P<0.05)。随着草果知母汤剂量增加，大鼠Racine评分逐渐降低(P<0.05)。详见图1。

模型组与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与草果知母汤低剂量组比较，△P<0.05；与草果知母汤中剂量组比较，▲P<0.05。

2.2 草果知母汤可升高癫痫大鼠海马组织GSH水平，降低ROS水平及铁含量 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织GSH水平降低(P<0.05)，铁含量及ROS水平升高(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组GSH水平升高(P<0.05)，铁含量及ROS水平降低(P<0.05)。随着草果知母汤剂量增加，大鼠海马组织GSH水平逐渐升高，铁含量及ROS水平逐渐降低。详见表2。

表2 各组大鼠海马组织ROS、GSH水平及铁含量比较(±s)

2.3 草果知母汤保护癫痫大鼠海马CA1区病理学变化 正常对照组大鼠海马组织结构正常，未见病理性改变；与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织CA1区炎症浸润，神经元缺失，神经元细胞数减少(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组大鼠海马组织病理学恢复，神经元细胞数增加(P<0.05)。大鼠海马组织CA1区HE、Nissl 染色检测结果见图2、图3。各组大鼠神经元细胞数比较见图4。

图2 大鼠海马CA1区HE染色结果(×400)

图3 大鼠海马CA1区Nissl 染色结果(×400)

2.4 草果知母汤可降低癫痫大鼠海马组织Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平降低(P<0.05)，Keap1 mRNA水平升高(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平升高(P<0.05)，Keap1 mRNA水平降低(P<0.05)。随着草果知母汤剂量增加，大鼠海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平逐渐升高，Keap1 mRNA水平逐渐降低。详见表3。

模型组与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与草果知母汤低剂量组比较，△P<0.05；与草果知母汤中剂量组比较，▲P<0.05。

表3 各组大鼠海马组织Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平比较(±s)

2.5 草果知母汤抑制癫痫大鼠海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达 与正常对照组比较，模型组大鼠海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度降低(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度升高(P<0.05)。随着草果知母汤剂量增加，GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度逐渐升高。详见图5～图8。

图5 免疫组化法检测大鼠海马CA1区GPX4蛋白表达

模型组与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05；与草果知母汤低剂量组比较，△ P<0.05；与草果知母汤中剂量组比较，▲ P<0.05。

图7 免疫组化法检测大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达

模型组与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05；与草果知母汤低剂量组比较，△ P<0.05；与草果知母汤中剂量组比较，▲ P<0.05。

2.6 草果知母汤可抑制癫痫大鼠海马组织Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表达 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表达降低(P<0.05)，Keap1蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，草果知母汤各剂量组及西药对照组GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P<0.05)，Keap1蛋白表达降低(P<0.05)。随着草果知母汤剂量的增加，大鼠海马组织GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表达逐渐升高，Keap1蛋白表达逐渐降低。详见图9。

模型组与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与草果知母汤低剂量组比较，△P<0.05；与草果知母汤中剂量组比较，▲ P<0.05。

3 讨 论

癫痫是由于大脑神经元异常放电进而导致大脑功能障碍的一种慢性疾病，然而，癫痫发作时临床表现复杂多样，其发病机制也不尽相同，所以目前临床对于癫痫的治疗方法有限，研发新型抗癫痫药物是目前临床的迫切需求。癫痫发作时神经元异常放电会引起海马神经元损伤，进而可能导致癫痫病人继发认知功能障碍等疾病。严建文[8]研究报道了癫痫大鼠海马神经元细胞减少，同时海马组织促凋亡基因表达升高；蔡栋梁等[9]同样报道了癫痫大鼠海马组织病理性改变并发生明显神经元凋亡。因此，在癫痫的治疗中，海马神经元的保护及修复是重要的治疗途径之一。丙戊酸钠是目前药理机制明确且临床应用广泛的治疗癫痫的药物，所以，本实验用其作为阳性对照组药物。

中医理论认为癫痫归属于“痴呆”“痫症”“癫症”等范畴，其病因与病人痰浊内生及情绪失调等因素有关。“痫为痰蓄，无痰不作痫”，同时指出癫痫伴认知障碍的病机关键在于“肾精亏虚、风痰闭阻”。草果知母汤是在中医理论指导下由草果、知母等中药材组成的中药成方制剂，其最早记载于中医学著作《温病条辨》中，具有燥湿清热的功效。现代医学研究发现，草果知母汤对癫痫动物模型有显著改善作用，甘贤兵等[10-11]先后研究发现草果知母汤及其加减方能够通过提高脑内γ-氨基丁酸(GABA)阳性神经元分布及受体表达进而抑制大鼠癫痫的发作及进展，同时能够降低大鼠惊厥发作级别。张丽萍等[12]研究发现，草果知母汤能够抑制癫痫引起的大鼠脑海马神经元形态结构病理性改变。然而，草果知母汤对于癫痫的治疗作用机制及其对铁死亡的抑制作用目前尚不清楚。

铁死亡是近年来研究发现的一种新的细胞死亡方式，其机制为细胞在金属元素铁的参与下发生脂质过氧化产物和致命性反应ROS积聚导致的细胞死亡，呈现出铁离子依赖性[13]。许璐等[14]研究发现铁死亡激活剂能够诱导小鼠海马HT22细胞凋亡，并导致细胞内ROS及铁含量升高，同时抑制海马组织细胞内铁含量及ROS水平，从而增强海马细胞活力，其机制可能与提高海马HT22细胞内HO-1水平有关。杨田丽等[15]研究发现HT22细胞内铁含量及脂质过氧化物水平升高则明显促进HT22细胞凋亡。曾劲松等[16]研究表明神经元铁超载导致神经元细胞死亡，其机制与细胞内铁含量升高进而导致GSH水平、GPX-4活性降低及ROS水平升高有关。本实验结果表明，与模型组比较，草果知母汤能够明显抑制癫痫大鼠海马组织铁含量及ROS水平，并升高海马组织GSH水平，且随着草果知母汤剂量的增加，海马组织铁含量及ROS水平明显降低，海马组织GSH水平升高更明显。

研究表明，细胞内Nrf2能够抑制细胞内氧自由基的活性，修复细胞损伤[17]。在细胞正常状态下，细胞内Nrf2与Keap1特异性结合，Nrf2的活性受到抑制，但细胞损伤时，Keap1与Nrf2发生解离，Nrf2被激活，进而激活下游HO-1及GPX-4水平，增强组织抗氧化能力，保护组织细胞免受氧化应激损伤。HO-1作为重要的抗氧化酶，在外界刺激及细胞因子引起的细胞氧化应激损伤中发挥重要的保护作用[18]。同时，研究表明，铁死亡诱导剂可直接或间接作用于GPX4，导致细胞内ROS堆积、触发细胞氧化死亡机制[19]。GPX4和Nrf2分别通过限制ROS产物和降低细胞内铁的摄取对铁死亡发挥负性调控作用[20]，因此，GPX4和Nrf2被认为是海马组织铁死亡的直接相关性蛋白。本实验结果表明，与模型组比较，草果知母汤各剂量组能够呈剂量依赖性降低大鼠海马组织Keap1 mRNA及蛋白水平，并升高Nrf2、GPX4及HO-1 mRNA及蛋白水平。

综上所述，草果知母汤能够修复癫痫大鼠海马组织氧化损伤，其机制可能与调节Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4通路进而阻断海马神经元铁死亡有关。