仲景方辨治惊悸病的特点及高频药对桂枝-茯苓核心通路靶点的筛选

王明珠，姚 磊，李建华，桂明泰，芦 波，周训杰，符德玉

惊悸多概括在心悸病证中，其本为气血不足、阴阳亏损，标为气滞、血瘀、痰浊、水饮等。张仲景在惊悸辨治中创制了许多经典方剂，如桂枝类方、真武汤、五苓散、炙甘草等。通过梳理惊悸病治法与方药应用，掌握其论治特点及核心药对，有助于总结归纳仲景方对惊悸病的辨证论治特点，并为后期机制探讨提供参考。

1 仲景方辨治惊悸病的特点

惊悸病名源自《黄帝内经》，《金匮要略·惊悸吐衄下血胸满瘀血病脉证治》提出了惊悸的病名，并系统论述了惊悸病的辨证施治。《说文解字》释义：“惊，马骇也”“悸，心跳也”。张仲景论述惊和悸分而别之，条文中言明以脉辨病：“寸口脉动而弱，动即为惊，弱即为悸”。“动”和“弱”的不同，表明了惊和悸的病因病机不同[1]。惊因外感，多属实证，常见于感受外邪导致心无所依，神无所归，故脉见动摇不宁；悸因内伤，多属虚证，常见于气血不足，心脉失养，故脉象细弱无力[2]。惊，惊恐，抽搐，以精神异常为主要表现，主脉：动脉；多自外来，涉及脏腑主要为心、肝、胆等；悸，以心跳或者其他部位的跳动为主要表现，主脉：弱脉。

“惊”多因临床表现不同分为惊痫、惊烦、惊狂等分而治之。惊痫者多因风热被火；惊烦者多因肝郁、邪热致心神不宁，方剂多选用柴胡加龙骨牡蛎汤；惊狂者多因心阳虚，方剂选用桂枝去芍药加蜀漆牡蛎龙骨救逆汤。“悸”的辨证多根据部位不同分为心悸、心下悸、心中悸、脐下悸。心悸者，多因心阴不足，选方为炙甘草汤；心下悸、心中悸的辨治，属心阳虚者用真武汤、桂枝甘草汤。饮停中焦者，茯苓甘草汤主之；水饮凌心者，半夏麻黄丸主之；胃中停水者，小半夏加茯苓汤主之；心血虚者，小建中汤主之；阳虚肢冷者，四逆汤主之；脐下悸者，因心阳虚者苓桂草枣汤主之；水停下焦者，五苓散主之[3]。详细条目见表1。

表1 张仲景辨治惊悸病的原文条目总结

现代中医内科学将惊悸包括在心悸中，指病人心中悸动，自觉不安，甚则不能自主的一种病证，多见于现代医学的心律失常。也可见于贫血、甲状腺功能亢进等以心律失常为主症的疾病中。西医学各种原因引起的心律失常，如心动过速、心动过缓、期前收缩、心房颤动或扑动、房室传导阻滞、病态窦房结综合征、预激综合征及心功能不全、神经官能症等，凡以心脏跳动不规则为主要临床表现时，均参考惊悸论治[4]。

2 高频药对桂枝-茯苓的基因靶点筛选

通过以上对《伤寒论》以及《金匮要略》中对惊悸病选方用药的总结，经过统计发现，在治疗惊悸病的方剂中，桂枝出现频率为8次，茯苓出现频率为6次，两者配伍多达5次，药对桂枝-茯苓出现频率最高。

桂枝其味辛、甘，性温，归心、肺、膀胱经，发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气；茯苓其味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，利水渗湿，健脾宁心。桂枝茯苓配伍多用于治疗惊悸、气短、失眠、水肿等症状。现代研究发现，桂枝为樟科樟属植物肉桂的干燥嫩茎，桂枝在治疗心血管疾病中主要起增加心血管流量、疏通心肌通透性的作用[5]；茯苓为真菌茯苓的干燥菌核，茯苓与桂枝配伍后对慢性心肌缺血具有更好的保护作用[6]。基于桂枝-茯苓药对配伍的特殊性，本研究运用现代生物信息学等研究手段，对桂枝-茯苓药对治疗心律失常的作用靶点进行预测及筛选，以期为实验及临床用药提供前期理论基础。

2.1 桂枝-茯苓化合物-基因靶点互作网络的构建 桂枝-茯苓化合物-基因靶点互作图见图1，内部红色三角形组成的圆为桂枝-茯苓治疗心律失常的主要作用成分，主要包括烯酸(enoic acid)、氢化松苓酸(trametenolic acid)、酒酵母甾醇(cerevisterol)、麦角甾(ergosta)、麦角甾醇过氧化物(ergosterol peroxide)、常春藤皂苷元(hederagenin)、花旗松素(taxifolin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。外圈绿色为基因靶点。具体操作方法参考文献[7]。

图1 桂枝-茯苓化合物与基因靶点的相互作用图

2.2 桂枝-茯苓核心基因靶点筛选 为了进一步筛选出可能性最大的基因靶点，本研究利用STRING数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl)构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，将获得的PPI网络利用Cytoscape软件中Cytohubba插件进行处理，Cytohubba可以发现复杂网络的关键目标和子网络并对基因进行筛选，根据nodes在网络中的属性，运用12种算法进行统计分析并对核心基因进行排序[8]。结果显示，基因关联度排名前20位由高到低为：CASP3、CASP8、CASP9、BCL2、BAS、ADRA1B、ADRB2、ADRA1A、CHRM1、PTGS2、SLC6A4、CHRM2、MAP2、CHRM3、SLC6A2、PGR、PRKCA、OPRM1、NR3C2、NCOA2。详见图2。

2.3 桂枝-茯苓干预心律失常的基因功能和信号通路分析 深入探究桂枝-茯苓药对干预心律失常的基因功能和可能涉及的信号通路，本研究利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)将基因靶点进行基因本体功能(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，分别筛选出排名前5位的条目进行作图，见图3。富集到生物过程GO条目有腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、突触传递胆碱能、环氧合酶途径；富集到细胞组成的GO条目有质膜组成、神经元投射、突触后膜反应、细胞连接；富集到分子功能的GO条目有G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、前列腺素内过氧化物合酶活性、过氧化物酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性。桂枝-茯苓药对干预心律失常主要信号通路为钙离子信号通路、细胞凋亡通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路。

图3 桂枝-茯苓药对干预心律失常GO富集分析以及KEGG通路分析

为了进一步阐释筛选的核心基因与信号通路的关系，利用R软件bioconductor程序包，对Bioconductor数据库(http://www.bioconductor.org/)进行KEGG通路富集分析，结果发现，排名前20位的基因中，富集到排名第1位的信号通路钙离子信号通路核心基因为CHRM3/CHRM1/CHRM2/ADRA1B/ADRA1A/ADRB2/PRKCA。详见表2。

表2 KEGG富集分析排名前5位的信号通路

3 讨 论

仲景之方，后世多尊之为经方，奠定了中医学辨证论治的基础。经方以药味的不同属性治疗人体不同部位寒热虚实，从而达到人体自身的阴阳平衡。仲景之方具有明显的核心倾向，形成以核心药物为主体，以常用药对为骨架，构建了以桂枝汤类、麻黄汤类、白虎汤类、承气汤类、柴胡汤类、理中汤类等为代表的类方方簇。其中，核心药物为桂枝、芍药、半夏、人参、茯苓等，核心药对为桂枝和芍药、桂枝和茯苓、麻黄和桂枝、人参和半夏、人参和桂枝等。类方方簇在经文中都有各自的适应证，但同类方剂也必然存在基本药对组成和相似的功用主治[9]。

药对即临床常用的、相对固定的两味药的配伍组合，是在长期的临床实践中由经验积累而逐步形成的。仲景方中药对的使用，是仲景常用的一种特定药物组配和方剂组成。《神农本草经》提出“有单行者、有相须者、有相使者、有相畏者、有相恶者、有相反者、有相杀者，凡此七情， 合和视之”。“七情”概括了药物配伍的基本形式，药对也构成了组方用药的基础。仲景之方，多含“药对”，配伍精当，与方剂的功效相关甚切，桂枝-茯苓用药规律以及其作用机制的研究对临床有借鉴意义[10]。

本研究发现，仲景方治疗惊悸病的方剂中，桂枝-茯苓药对出现的频率最高，通过生物信息学分析等手段对桂枝-茯苓药对的潜在基因靶点和信号通路进行筛选，发现桂枝-茯苓药对可能通过调控钙离子通道中的核心基因CHRM3/CHRM1/CHRM2/ADRA1B/ADRA1A/ADRB2/PRKCA干预心律失常。

与本研究结果相似，姜开运等[11]利用现代数据挖掘技术研究发现，《普济方》中含茯苓复方的治疗病证前3名为虚损599首方剂、虚劳305首方剂、惊悸286首方剂。汪琼等[12]以国医大师公开发表或出版的医案医话为研究对象，挖掘国医大师应用桂枝常用药对信息，以及核心药对与疾病的关联。结果提示，常用药物频次统计在1 133首含有桂枝的处方中，共涉及药物525味，国医大师应用桂枝的常用药对组合有31个，出现频次最高的药对是茯苓-桂枝(444次)。这些研究结果表明，不管从仲景方还是后世医家和近现代名医在惊悸病的辨证施治中，桂枝-茯苓药对应用广泛，发挥了重要作用。

随着现代医学对心律失常发病机制的深入研究，发现心脏电信号传导是心律失常重要发病机制之一[13]。其基础是心肌细胞跨膜离子通道电流，心肌细胞钠、钾、钙等离子通道顺序开放并保持动态平衡是心脏正常工作的基础。离子通道间功能平衡失调，心肌电信号传导紊乱，诱发心律失常[14]。越来越多的心律失常被证实与基因缺陷有关，其中多数为心脏离子通道基因异常。钙离子是维持心脏正常节律及兴奋收缩偶联的关键离子，心肌细胞主要存在两种类型的钙离子通道：L型钙通道和T型钙通道，钙离子通道相关蛋白的基因突变，可导致严重的心律失常[15]。

在一项临床研究中，研究对象包括213例原发性心肌梗死急性期出现室性心律失常的病人和181例有心肌梗死但没有室性心律失常的病人。所有病人均无其他心脏病史。采用逆转录-聚合酶链式反应对病人进行ADRB2 Gln27Glu多态性基因分型。研究发现ADRB2 Gln27Glu病人更有可能在胸痛后60 min内出现早期室性心律失常，ADRB2基因多态性与原发性心肌梗死早期室性心律失常有关[16]。

体内实验研究发现，通过依赖钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的Ryanodine受体过度磷酸化可以诱发早期后除极，增强触发活动，从而导致心房颤动的发生，其主要机制为肌浆网钙离子释放与钠钙离子交换，导致肌浆网内钙离子减少和舒张期钙离子内流。并且动物实验研究表明有CaMKⅡ磷酸化的RyR2结构的转基因小鼠对诱导心房颤动的敏感性较强[17]。在体外心肌细胞实验中，Liu等[18]研究发现，在SD大鼠心肌细胞中，KCNE2基因的高表达可减少L型钙通路电流(ICa-L)电流，而通过RNA干扰KCNE2表达可升高ICa-L电流，说明KCNE2基因突变可能通过调控ICa-L来干预心房颤动。高龄小鼠(约24月龄)舒张期SR钙离子泄漏比低龄小鼠(约16周龄)多，KN-93可改善SR钙离子泄漏[17]。越来越多的证据表明，microRNA在心血管基因表达中发挥调控作用，microRNA可通过影响心脏离子通道基因的表达，引发心律失常。相关的临床和实验研究发现，miRNA-1、miRNA-21表达上调可抑制L型钙通道的表达，进一步引发心律失常等[19-23]。钙通道阻滞药主要对心肌细胞中的钙离子产生抑制性作用，进而降低心肌收缩、心肌耗氧等，起到降低自律性的作用。因此，恢复正常细胞内钙稳态可成为心律失常的一个潜在的治疗靶点[24]。

心律失常的治疗是近年来心血管疾病研究的难点和热点之一，目前抗心律失常药物的安全性和有效性未能令人满意。在寻求新的治疗策略中，发挥中医药的独特优势至关重要。目前，中医药治疗心律失常的临床研究较多，然而尚缺乏全面深入研究和机制探讨，以期在中医药治疗本病临床疗效的基础上，发挥中医药整体调治、双向调节的优势，加强方药的协同作用分析，更加重视经方的研究，注重拆方和核心药对的研究。同时运用现代基因测序等技术，着手于更先进、更严密的技术支持下，更深入、更全面地掌握中药抗心律失常的作用机制。在临床方面进行更大样本、更具说服力的研究，为临床提供更有力的依据，使中医药治疗心律失常的整体水平和科研水平得到进一步提高。