低氮胁迫下胡杨离子平衡和硝酸盐分配的调控响应

张 林， 孙玉芳， 高永峰， 姚银安

(1.西南科技大学生命科学与工程学院， 绵阳621010；2. 新疆农业大学林学与园艺学院， 乌鲁木齐830052)

胡杨(PopuluseuphraticaOliv.)不仅具有很强的耐盐碱能力，也能够忍受低氮瘠薄环境。然而，对其低氮耐受生理机制还研究甚少。研究采用中等程度的低氮胁迫，考察其营养响应、离子平衡、氮素分配和转录水平，为厘清胡杨低氮耐受机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实生胡杨苗种植于10 L盆中，盆内采用石英砂∶蛭石∶沙土(1∶1∶2)培养基，1/2 Hoagland溶液培养。培养3个月后选择长势一致的植株进行试验。低氮处理组采用15 mg/L NH4NO3水平(0.19 mmol/L NH4NO3)；对照组采用450 mg/L NH4NO3水平(5.62 mmol/L NH4NO3)，其他大量营养元素和微量元素均为1/2 Hoagland水平(不含有其他氮素)，满足植物的正常营养需求。设3个重复，每个重复4株植物。4周后，对胡杨的根、茎、叶进行采样，用去离子水洗涤。将收获的一半样品立即冷冻于液氮中，用于RNA提取，反转录后进行实时荧光定量PCR分析，测定脂质过氧化特性、叶绿素等生理性状。剩余一半在70 ℃条件下烘干至恒重，用于测定游离无机离子和总碳、总氮含量。

1.2 方法

1.2.1 光合色素、丙二醛、碳氮含量和离子含量测定

1.2.2 总RNA提取和相关基因的定量分析

采用RNA提取试剂盒(TianGen，中国北京)提取总RNA。用超微量分光光度计(Quawell / Q6000)检测RNA的质量和浓度，并结合电泳检测RNA的质量。按照第一链cDNA Synthesis Kit获得cDNA，并将该cDNA用于后续实验。按照TransStart Green qPCR SuperMix UDG (Catalog# AQ111-02)用户指南进行qPCR反应。通过实时定量PCR (qRT-PCR)分析硝酸转运和硝酸盐同化相关基因的表达情况。采用PotriActin和PotriUBQ作为参比，目标基因的相对表达丰度用2-ΔΔCT方法进行计算。

设计引物所用的数据库网站链接为：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 25.0统计软件进行分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验显著性差异，用Origin 9软件制图。

2 结果与讨论

2.1 胡杨的碳氮水平和胁迫程度

经过4周近1/30浓度的低氮处理，胡杨叶片和根中的总氮含量[图1(a)]都显著降低(叶片降低了23.3%，根系降低了19.8%)。低氮处理下植株总碳含量根系下降，叶片保持不变[图1(b)]，从而导致叶片碳氮比提高、氮素利用率提高[17]。暗示低氮对胡杨的光合作用影响不大，即胡杨对低氮具有一定的耐受能力。图1(c)显示，胡杨叶片和根系的碳氮比(C/N)分别达到30和20以上，与生长较慢的新疆杨类似，远高于速生性和吸氮能力较强的树种[10]，表明其氮素利用率较高。此外，胡杨的根系含氮量高于叶片，而其他速生性较强的杨树根系含氮量远低于地上部，表明胡杨为保证根系活力保持了较高的氮素含量，有利于耐受低氮胁迫。

* 为P<0.05。图1 胡杨叶片和根内的碳氮含量及比值Figure 1 The concentration of carbon and nitrogen and C/N ratio in leaves and roots of Populus euphratica Oliv.

与植物总的碳氮含量变化一致，在低氮处理条件下，胡杨叶片中的总叶绿素含量和类胡萝卜素含量下降幅度达到显著水平(P<0.05)[图2(a)]。低氮下叶片中丙二醛含量上升了21.0%，根中丙二醛含量上升了76.4%，表明其根系氧化胁迫程度更高。胡杨根系首先感受到氮素匮乏，进而传导到根系氧化还原信号发生变化，其副产物就是丙二醛含量升高；植株在感受到氧化胁迫信号后启动根系生长过程，与对照相比，低氮下根系更长，表明胡杨对低氮胁迫具有灵敏的响应。

* 为P<0.05。图2 胡杨植物光合色素和丙二醛含量Figure 2 The concentration of photosynthetic pigment and malondialdehyde in plants of Populus euphratica Oliv.

2.2 离子分配

* 为P<0.05。图3 胡杨叶片和根中阴离子和阳离子的含量Figure 3 The concentration of anions and cations in leaves and roots of Populus euphratica Oliv.

2.3 硝酸盐分配和同化的转录调控

对拟南芥NRT1.1的研究表明：若环境中氮含量高，NRT1.1会形成二聚体，二聚体是较为刚性的结构，亲和力低转运速度慢；若环境中氮含量低，NRT1.1的Thr101发生磷酸化，二聚体解聚，成为比较柔性的结构，亲和力高转运速度快。根系硝酸盐浓度变化调控NRT1.1的聚合状态和转运活性。低氮处理下，胡杨NRT1.1的转录水平变化不明显[图4(a)]，可能与NRT1.1蛋白翻译后调控有关，而不是在转录水平上变化。然而，胡杨NRT1.2表达水平降低。通常认为，NRT1.2蛋白是一个底物浓度依赖的低亲和力硝酸盐转运蛋白，因此胡杨根系中NRT1.2的表达量受根系外硝酸盐浓度降低的前馈作用而降低。

(a)胡杨根部；(b)胡杨叶片；(c)胡杨树皮。* 为P<0.05。图4 胡杨各部位(根、叶和树皮)硝酸盐转运体的表达Figure 4 Relative expression of nitrate transporters in roots, leaves and bark of Populus euphratica Oliv.

(a)根部；(b)叶片。* 为P<0.05。图5 根部和叶片中氮同化相关的基因的相对表达量Figure 5 The expression of genes related to nitrogen assimilation in roots and leaves in Populus euphratica Oliv.

3 结论