基于生物信息学分析微小染色体维持蛋白2在头颈部鳞状细胞癌中的表达及意义

黄舒婷温 炬江奕恒秦 思

1.广东省第二人民医院民航院区门诊部，广东广州 510405；2.广东省第二人民医院皮肤性病科，广东广州 510317

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界上第六大常见癌症类型，每年约有80余万例新增确诊患者，死亡率占所有恶性肿瘤的1%～2%，在我国，每年新增22.5万例，死亡10.3万例。由于HNSCC发病部位特殊，临床特征不明显，往往患者确诊时已处于晚期，而晚期HNSCC常易发生转移。目前，临床上对头颈部肿瘤的诊断主要依靠影像学检查，容易发生漏诊。微小染色体维持蛋白2（minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是参与真核细胞DNA复制启始和延长调控的关键蛋白，研究发现其在宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等疾病中有重要意义，但在HNSCC中研究甚少。本研究通过生物信息学技术探究MCM2在HNSCC中的表达，为HNSCC的诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 MCM2作为差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）的鉴定

运用基因表达公共（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载GSE2379和GSE23036数据集，共包含99个HNSCC样本和31个正常样本，并定义|logFC|＞1且调整后的P值＜0.05的基因为DEG。

1.2 UALCAN数据库分析

运用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的UALCAN网站可在线分析多种恶性肿瘤的临床数据，获取特定基因在不同组织中的表达情况。本实验通过分析UALCAN网站的数据，使用GraphPad Prism 9.3.1软件对数据重新可视化，探讨不同因素下正常组织和HNSCC样本中MCM2的表达情况及意义。

1.3 TIMER数据库免疫分析

肿瘤免疫评估资源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）数据库是一个基于TCGA数据库系统分析不同癌症类型免疫细胞浸润的网站，通过该数据库分析HNSCC中MCM2与多种免疫细胞的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.4 关键基因的筛选和构建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络

Linked Omics数据库收集了32种TCGA癌症类型和10种临床蛋白组学肿瘤的多组学数据，在该数据库中利用Pearson检验分析并筛选出与MCM2密切相关的前5个正相关基因作为关键基因，运用STRING数据库分析以上基因的PPI网络。

1.5 GSCALite数据库分析

GSCALite数据库是用于基因表达、单核苷酸变异，甲基化，通路活性和药物敏感性等分析的平台，使用该数据库对MCM2及其相关关键基因的药物敏感性进行分析。

2 结果

2.1 MCM2在HNSCC中的表达

数据集GSE2379和GSE23036中，MCM2在HNSCC肿瘤组织中的表达均高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1A）。通过筛选DEG并绘制火山图（图1B），观察到MCM2是一个上调的DEG，提示MCM2在HNSCC中高表达并在致癌性中起作用。

图1 MCM2在GEO数据库中的表达

2.2 HNSCC患者中不同因素对MCM2表达的影响

不同年龄段HNSCC中MCM2的表达均高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），41～60岁组别MCM2的表达量最高。不同性别HNSCC中MCM2表达均高于正常组织，且男性患者高于女性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同肿瘤分级HNSCC中MCM2表达均高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤分化越差者，MCM2表达水平越高。不同临床分期HNSCC中MCM2表达均高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），而不同临床分期HNSCC 的MCM2表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同分级淋巴转移的HNSCC中MCM2表达高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），但MCM2的表达与肿瘤转移程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染与否的HNSCC中MCM2表达均高于正常组织，且HPV阳性患者MCM2表达高于HPV阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 UALCAN数据库中的MCM2表达量比较

2.3 HNSCC中MCM2的表达与免疫细胞的关系

TIMER数据库分析显示，HNSCC中MCM2与B细胞、CD8T细胞、CD4T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平均成正相关（P＜0.05）（图3）。

图3 MCM2与常见免疫细胞的相关性分析

2.4 HNSCC中关键基因的共表达分析

Linked Omics数据库筛选出与MCM2显著正相关的前5个基因作为关键基因，包括微小染色体维持蛋白6（minichromosome maintenance complex component 6，MCM6）、微小染色体维持蛋白5（minichromosome maintenance complex component 5，MCM5）、无齿E3泛素蛋白连接酶同源物（Denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL）、昼夜节律调节蛋白（timeless circadian regulator，TIMELESS）和DNA聚合酶θ （DNA polymerase theta，POLQ）。利用STRING数据库进行PPI网络分析（图4）。

图4 MCM2的共表达基因

2.5 MCM2对癌症相关调节药物的影响

通过分析6个关键基因的药物相关性，发现MCM2对曲美替尼、司美替尼和RDEA119等药物耐受，对NPK76-II-72-1、Navitoclax、GSK1070916和I-BET-762等分子类药物敏感（图5）。

图5 关键基因与药物的相关性

3 讨论

本实验通过GEO数据库多数据集分析显示，HNSCC中MCM2的表达较正常组织异常增高，且在不同年龄组别、性别、肿瘤分级、临床分期和有无淋巴转移情况的HNSCC中MCM2均显著升高。蔡开贵等通过免疫组化染色发现MCM2的表达与人喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）的病理分级、临床分期和淋巴结转移成正相关。但也有研究发现与早期LSCC相比，晚期喉癌患者MCM2的表达水平显著降低。本研究提示HNSCC中MCM2的异常表达与HPV感染情况有关联，王鲲鹏等研究发现MCM2可能是HPV阳性HNSCC诊断及预后的标志物。以上结果表明，MCM2异常表达与HNSCC疾病的严重程度和癌症进程有关。

不同类型的免疫浸润细胞可通过直接或间接相互作用调节癌细胞的生长和转移，然而，MCM2与HNSCC肿瘤免疫浸润细胞的关系至今尚无报道。本研究发现MCM2与多种免疫细胞的浸润水平密切相关，提示MCM2调控头颈部鳞癌患者的免疫状态，影响肿瘤的进展。此外，MCM2是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生存率下降的独立危险因素。Kodani等发现中分化OSCC具有更高的MCM2标记指数，与患者的预后相关。

研究发现MCM2可被多种药物抑制，考虑MCM2是治疗HNSCC的潜在治疗靶点。Ahmadinejad等研究表明抗凋亡蛋白抑制剂（Navitoclax）可干扰抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间的相互作用，激活后者诱导细胞死亡。联合Navitoclax治疗较单用顺铂治疗，能有效防止HNSCC的复发。GSK1070916为极光激酶B/C抑制剂，靶向作用于有丝分裂突变信号通路，可消除转移的慢性粒细胞白血病和急性髓性白血病而不损伤卵巢组织，防止白血病的复发。I-BET-762是一种新的溴域抑制剂，可逆地靶向作用于溴结构域和超末端结构域（bromodomain and extra terminal domain，BET）蛋白，削弱其与组蛋白上的乙酰化赖氨酸结合的能力，阻断下游转录。Zhang等发现I-BET-762可延迟乳腺癌和肺癌临床发病前期的肿瘤发展，诱导肿瘤细胞生长阻滞，在癌症的预防治疗上有广阔的应用前景。NPK76-II-72-1目前尚无相关文献的报道，且GSK1070916和I-BET-762在HNSCC的相关文献中均无研究，是未来研究HNSCC治疗靶点的新方向。

综上所述，头颈部肿瘤病灶部位和病理类型多，解剖关系复杂，生物靶点为其临床诊断和靶向免疫治疗提供了新思路。本研究提示MCM2是头颈部鳞状细胞癌潜在的肿瘤标记物和治疗靶点。