骨痿不同中医证型中血瘀与PPARγ、Runx2相关性研究

陈德骏 梁祥翰 黄宏兴 朱根福 黄幸儒 方坚廖荣臻*

1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510006 2.广州中医药大学第三附属医院(广东省中医骨伤研究院)，广东 广州 510378

骨质疏松症(osteoporosis，OP) 是一种普遍的全身性代谢性骨病，其主要机制是骨形成和骨吸收之间的稳态遭到破坏，导致骨重建的失衡[1]。中医称之为“骨痿”。近年来，骨痿已成为影响我国中老年人生活的主要骨骼疾病之一，提早防治刻不容缓。既往的研究[2]发现，PPARγ、Runx2在骨质疏松症的代谢平衡中起着重要作用。一项动物实验研究[3]发现，PPARγ缺失小鼠模型表现出骨量增加，表明PPARγ与成骨分化呈负相关。此外，Runx2通过与hedgehog、Wnt信号分子以及Dlx5、Sp7等转录因子，相互调控成骨细胞的增殖、分化来抑制破骨形成，从而促进成骨，维持机体骨稳态，防止骨量丢失[4-5]。目前在中医药普遍运用于防治骨质疏松下，血瘀在骨质疏松领域受到广泛关注，活血化瘀药在调节骨代谢改善骨质疏松方面发挥独特优势，但其分子途径尚不明确。有研究[6]报道PPARγ、Runx2信号通路通过MAPK磷酸化，而MAPK途径是血瘀形成重要通路，同时有关PPARγ、Runx2的表达与骨痿不同中医证型中血瘀的相关性研究鲜见报道。因此，本研究对不同中医证候类型的骨痿患者进行上述指标的对比研究，旨在探讨骨痿患者不同中医证候类型的PPARγ、Runx2表达情况及其与血瘀内在联系，对于进一步认识骨痿患者血瘀的发生机理及指导中医药精准靶药治疗具有重要意义。总结报告如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料

2019年1月至2021年1月期间，收集在广州中医药大学第三附属医院关节中心基于骨密度检测，诊断为骨痿，计划因合并髋关节病行人工全髋关节置换术治疗的病例。该试验经医院医学伦理委员会审查并批准实施(2020036)。

1.2 骨质疏松症(骨痿)标准

根据《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识(2020)》[7]及王少山等主编《骨病中西医诊疗学》[8]中骨质疏松症(骨痿)拟定的标准。

1.2.1骨痿诊断标准：依据全身双能X线骨密度仪(DXA)测定腰椎1～4及股骨颈骨密度T值≤-2.5，确诊为骨痿。

1.2.2中医证候标准：①脾肾阳虚证：腰膝酸软、或五更泄、或腹部冷痛，舌淡、苔白或厚腻，脉沉弱等；② 肝肾阴虚证：口干舌燥，腰膝酸软，潮热盗汗，舌红少苔，脉细数等；③气滞血瘀证：腰背酸胀，骨节刺痛，疼痛固定，舌紫暗，或瘀斑，脉细涩等。

1.2.3纳入标准：①以DXA测定腰椎1～4及股骨颈骨密度的T值≤-2.5；②确诊为骨痿(骨质疏松症)；③年龄：60～80岁；④合并髋关节病，拟行人工全髋关节置换术治疗的患者。

1.2.4排除标准：①非骨痿患者；②患者<60岁或>80岁；③合并如代谢性骨病、类风湿性关节炎等疾病累及关节者；④患有严重原发性疾患如心血管病及精神病者等。

1.3 方法

1.3.1骨密度检测：入院第二天所有病例的腰椎及股骨颈骨密度值均通过全身双能X线骨密度仪(Unigamma X Ray Plus，意大利)检测。

1.3.2辨证分型：由3名主任中医师参考《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识(2020)》[7]以及王少山主编《骨病中西医诊疗学》[8]独立对符合纳入标准病例进行中医辨证分型，最终纳入病例分型为肝肾阴虚型、脾肾阳虚型、气滞血瘀型3种证型。予以剔除辨证分型过程3者结论差异较大的病例。

1.3.3主要试剂与器材：抗体PPARγ (批号：sc-7273，美国Santa公司)；抗体Runx2、GAPDH(批号：12556，5174，美国Cell Signaling Technology公司)；PVDF膜(型号：ISEQ00010，美国Millipore公司)；电泳仪(JS-Power300，上海培清科技有限公司)；全自动生化分析仪(型号：C16000，美国雅培公司)。

1.3.4血液指标测定：入院第二天晨起，抽取入组病例空腹外周静脉血，以全自动生化分析仪检测相关凝血指标：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fbg)及D-二聚体(D-D)。

1.3.5Westernblot检测：患者充分了解研究方案，并自愿签署知情同意书，入院第三天行髋关节置换手术时留取股骨颈髓腔开路的松质骨标本，保存于-80 ℃低温环境。再以Western blot蛋白印记法检测不同证型骨痿患者松质骨标本中PPARγ、Runx2蛋白的表达。用PBS干预后洗涤2次，加入RIPA裂解缓冲液裂解细胞，提取蛋白，采用SDS-PAGE进行电泳分离，选取PVDF膜，然后将目标蛋白转至PVDF膜上，置于TBST(含5 %脱脂牛奶)中，室温封闭 2 h；使用相应的一抗及二抗检测，包括抗PPARγ、抗Runx2、抗GAPDH抗体及对应二抗。蛋白质以ECL发光试剂法检测，每个条带代表蛋白的表达量的吸光度值以凝胶分析软件测定。最终以蛋白表达量与内参GAPDH表达量的比值作为本研究的观察指标。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 研究对象一般资料比较

本研究共94例患者符合纳入标准。通过辨证分析和证素提取，将纳入患者辨证为肝肾阴虚型39例、脾肾阳虚型30例、气滞血瘀型25例。3种证型患者的基线水平均衡，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 3种症候类型骨痿患者的基线资料

2.2 3种证候类型骨痿患者的凝血功能比较

3种症候类型骨痿患者的血清PT、TT、Fbg水平相比，差异无统计学意义(P>0.05)。气滞血瘀型骨痿患者的血清APTT及D-D水平相比肝肾阴虚型及脾肾阳虚型骨痿患者血清APTT及D-D水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：*P<0.05，**** P<0.0001。图1 3种症候类型骨痿患者的凝血功能检测结果Fig.1 Results of coagulation function test in patients with three syndrome types of flaccidity of bones

2.3 3种证候类型骨痿患者的松质骨PPARγ、Runx2蛋白比较

相比肝肾阴虚型及脾肾阳虚型骨痿患者的松质骨PPARγ蛋白水平，气滞血瘀型骨痿患者的松质骨PPARγ水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。相比肝肾阴虚型骨痿患者的松质骨Runx2蛋白水平，脾肾阳虚型及气滞血瘀型骨痿患者松质骨的水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。气滞血瘀型骨痿患者的松质骨Runx2蛋白水平相比脾肾阳虚型骨痿患者松质骨其蛋白水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，图2。

注：*P<0.05，**** P<0.0001。图2 各组骨痿患者松质骨PPARγ、Runx2蛋白表达的比较Fig.2 Comparison of PPARγ and Runx2 protein expression in cancellous bone of patients with flaccidity of bones among all groups

图3 各证候类型骨痿患者松质骨Western印迹比较Fig.3 Comparison of Western blotting results of cancellous bone in patients with different syndrome types of flaccidity of bones

3 讨论

骨质疏松症在传统中医学中并无病名，由于其病因病机、临床表现和体征，中医将其归类为“骨痿”的范畴。《素问·痿论》有云：“肾主身之骨髓……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓消，发为骨痿”。古人认为，肾脏负责藏精及化生骨髓，肾精的盛衰与骨的强度密切相关。肾精丰盈时，骨髓生化有源；肾热精伤，则导致骨髓生化之源受损，故发为骨痿。此外，饮食不节，久之脾胃功能衰弱，运化无力，气血无源无以滋肾充骨，精伤髓减，也可致骨痿。如《金匮要略》说：“咸则伤骨，骨伤则痿”。而王清任在《医林改错》亦指出“元气既虚……血管无气，必停留而瘀”。血瘀是骨痿的主要病因病机之一，随着年龄的不断增长，元气渐虚，血行无力，淤血阻于骨络，骨髓失养，出现骨骼脆弱乏力，同时气血运行失于通畅，脏腑失养，加重本虚，两者互为因果，渐而形成骨痿。所以，骨痿的形成主要在于脾、肾、血瘀。对此，赵宇等[9]认为骨痿之本在于肾虚，兼见肝脾亏虚，其标在于血瘀，其中肾虚与血瘀互为因果。万雷等[10]指出，血瘀理论、肾主骨理论、脾肾相关理论是黄宏兴教授治疗骨痿的基础理论。可见，脾、肾、血瘀与骨质疏松密切相关，3者皆是骨痿发生与发展极其重要的因素。

现代研究认为骨质疏松症主要是与成骨细胞的分化缺陷和脂肪生成增加密切相关[11]。骨髓间充质干细胞受两个关键调节因子转录因子PPARγ和Runx2调节，分化脂肪细胞和成骨细胞形成脂肪和骨。PPARγ是调节脂肪细胞生成与分化的关键因子，也是抑制成骨分化程序的转录因子[12]。而Runx2在调节成骨细胞分化方面至关重要，是成骨细胞分化所必需的一种转录因子。PPARγ和Runx2调控骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞、破骨细胞或脂肪细胞，而骨代谢的平衡又取决于成骨细胞和破骨细胞的分化和调节[13]。以往研究已证实PPARγ能抑制Runx2的表达，进而抑制其成骨基因的表达，所以抑制PPARγ活性与增强成骨密切相关[14-15]。如果PPARγ长期属于被激活状态，通过抑制Runx2基因启动子的启动，可以干扰Runx2的转录和表达，降低成骨细胞水平，最终使骨髓间充质干细胞向脂肪细胞大量分化，导致骨内压增高，血液回流障碍，使得成骨分化不足，最终引起骨质流失、骨质疏松等骨代谢性疾病[16-17]。本研究结果显示，气滞血瘀型骨痿患者的PPARγ蛋白表达水平高于肝肾阴虚型及脾肾阳虚型，表明气滞血瘀型患者可能较其他证型存在较高骨量丢失。近年来已有临床研究证实了这一点，张鹏等[18]研究发现骨痿气滞血瘀型患者较肾阳虚衰型、肝肾阴虚型存在较高骨代谢水平。李小圳等[19]同样发现在241例患者中81例气滞血瘀型与其他证型相比，骨密度平均值T最低(-3.03)。而与本研究中气滞血瘀型存在Runx2和PPARγ同样高表达似乎矛盾，其中因素可能与破骨细胞分化增加，机体保护性应激反应增强Runx2表达来增强成骨细胞分化，实现骨重塑的平衡有关，但骨痿患者骨髓成脂能力更强[20]，同时也可能与骨髓脂肪细胞分泌脂联素、瘦素等脂肪因子有关，有研究[21]显示，这些因子对骨量影响是双向的，通过相关分子通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

血瘀既是骨痿发生的重要因素，又是骨痿病理产物。血瘀形成可引起骨微循环障碍，导致成骨细胞和破骨细胞代谢功能絮乱，减缓新骨合成和旧骨吸收速度，造成骨重建失衡，从而引发或加重骨质疏松[22-23]。为了进一步验证不同证型骨痿患者的PPARγ、Runx2相关表达与血瘀是否具有一定的相关性，本研究进行3种证型骨痿患者的凝血功能比较，结果表明，气滞血瘀型骨痿患者的血清APTT及D-D水平明显高于其他两种证型，表明气滞血瘀型骨痿患者的PPARγ、Runx2高表达与血瘀具有一定的相关性。这可能与MAPK途径激活是血瘀形成的重要通路及PPARγ、Runx2表达依赖MAPK途径磷酸化有关。既往研究[6]发现Runx2和PPARγ通过MAPK依赖的磷酸化而调节机体，而MAPK途径激活最终诱导凝血因子表达及脂质代谢絮乱[24-25]。一方面，通过MAPKs信号通路中p38 MAPK、JNK及ERK蛋白磷酸化水平会对凝血系统产生影响，尤其p38 MAPK，p38 MAPK的激活，导致cAMP水平下降，上调P-选择素的表达以及抑制aIIBβ3激活，从而刺激血小板活化，促进血栓的形成[26]。另一方面已证实脂质代谢絮乱是构成微循环障碍的重要高危因素，PPARγ通过MAPK途径磷酸化致使脂质累积，可相继引起血管内皮损伤、动脉粥样硬化、增加血液黏稠等一系列血管病变及血流动力学改变，这些改变如血管内皮损伤可促使组织因子(TF)释放，启动相关凝血机制，进而启动血液凝固级联反应，促进血栓形成[25,27-29]。目前关于PPARγ、Runx2的表达与血瘀相关性研究较少，而两者是否通过MAPK途径或者其他分子通路干预血瘀形成，本研究将在下一步课题深入研究证实。

综上所述，本研究通过骨痿患者松质骨PPARγ、Runx2蛋白表达及凝血功能结果，初步探讨了患者PPARγ、Runx2与肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、气滞血瘀证3种证型表达差异性及与凝血指标的相关性，进一步明确不同证型骨痿的蛋白表达情况以及血瘀在骨痿的发病过程中的重要作用，为活血化瘀法及中药中分子作用靶点治疗骨痿提供一定的辨证施治依据。