乙酰化蛋黄果多糖及其抗氧化活性研究

贾朋贺，田轶男，徐晓军，曾斯杰，杨定国，韩长日，刘 红,*

乙酰化蛋黄果多糖及其抗氧化活性研究

贾朋贺1，田轶男1，徐晓军1，曾斯杰2，杨定国3，韩长日3，刘 红1,2*

1. 海南师范大学化学与化工学院，海南海口 571158；2. 海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南海口 571158；3. 海南科技职业大学药食同源植物资源海南省重点实验室，海南海口 571126

蛋黄果（A. DC）乙酰化修饰多糖的抗氧活性优于未修饰多糖，通过分析乙酰化蛋黄果多糖的乙酰化度、红外光谱和形貌特征，阐明引起抗氧活性提升的原因。试验采用超声波辅助法提取蛋黄果果肉粗多糖，用三氯乙酸法除去蛋白质得到多糖。选取3份0.50 g多糖加入20% NaOH溶液溶解，分别加入1、3、5 mL乙酸酐，得到3种取代度（0.237±0.05、0.275±0.07、0.228±0.04）的乙酰化蛋黄果果肉多糖，评价其清除DPPH自由基、OH自由基和ABTS自由基的能力。结果表明，乙酸酐添加量由少到多时，蛋黄果多糖乙酰基取代度先显著升高，后趋于平缓下降。乙酰化蛋黄果多糖的红外光谱显示了3417 cm–1（–OH）、2950 cm–1（–CH）处的伸缩振动和1636 cm–1处的（–OH）转动振动，1738 cm–1处出现酯基C=O的伸缩振动吸收峰，表明乙酰化已经成功接入。扫描电镜结果显示，未经乙酰化的蛋黄果多糖表面相对光滑平整，呈片状结构；乙酰化修饰多糖分子间交联增强，构象发生了变化，变为表面形状不规则，出现很多空隙且表面粗糙。3种乙酰化蛋黄果多糖中DHG-Ac2（3 mL醋酐）清除效果最好，在浓度1.0 mg/mL时，DPPH清除能力、ABTS自由基清除率、OH自由基清除率分别为91.37%、58.73%、56.36%，分别高于蛋黄果多糖10.0%、43.7%、25.3%。这是引入的乙酰基能活化多糖链中的异头碳，使多糖的供氢能力提升，继而提升乙酰化蛋黄果多糖的抗氧化作用。本研究为海南产蛋黄果多糖的深入开发与抗氧化应用提供了基础研究数据。

乙酰化多糖；结构修饰；抗氧化活性；蛋黄果

蛋黄果（A. DC），原产于古巴、北美洲热带，树姿美丽，果形美观，果肉似蛋黄，故名为蛋黄果[1]。蛋黄果果肉营养非常丰富，含有膳食纤维、碳水化合物、多种矿物质、维生素、脂肪和蛋白质等，可加工制成果酱、饮料和果酒等，是具有广泛研究前景的优质食用资源[2]。近年来，蛋黄果的淀粉、成熟度、多糖研究受到学者的关注，如蛋黄果淀粉的物化性质、多尺度超分子蛋黄果淀粉结构分析等[3]。蛋黄果成熟期分3个阶段，当果皮颜色从绿变黄时，其硬度和可滴定酸度下降[4]，不同成熟度的淀粉和多糖的积累程度不同，因此选择成熟度非常重要。由于蛋黄果多糖具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗癌、免疫调节、抗疲劳、维持肠道稳态保护肝脏、抗病毒、降血糖等重要的生物活性[5]，且蛋黄果种子多糖的抗氧化性优于果肉[6]。多糖乙酰化修饰的研究报道显示乙酰化的大蒜多糖[7]、青钱柳多糖[8]、银耳多糖[9]、秀珍菇多糖[10]、石斛多糖[11]等抗氧化性优于未修饰多糖，其中乙酰化青钱柳多糖提高H2O2处理树突状细胞的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性[8]；乙酰化石斛多糖促进RAW 264.7巨噬细胞的吞噬活性和一氧化氮释放[11]。鉴于乙酰化蛋黄果多糖的研究未见报道，本研究将果肉多糖进行乙酰化修饰和表征，探究乙酰化蛋黄果多糖引起抗氧化性提升的原因，旨在为海南产蛋黄果多糖的深入开发与抗氧化应用提供了基础研究数据。

多糖的乙酰化是指在碱性水溶液条件中利用乙酸酐与多糖的羟基氧进行反应，乙酰化度大小影响多糖的生物活性。由于多糖在强碱溶液中溶解，制备乙酰化多糖必须保证在碱性条件下进行反应，同时乙酸酐的添加量将直接影响乙酰化度。CHEN等[7]将1.5 g大蒜多糖溶解于15 mL蒸馏水，缓慢加入5 mL乙酸酐和10% NaOH溶液控制pH在7～11之间，于30℃保持2.5 h，然后加入10 mol/L HCl调节pH为7，反应终止得到抗氧化性较好的乙酰化大蒜多糖。

乙酰化修饰多糖改善多糖结构，提高多糖的溶解度和抗氧化性。乙酰基激活多糖氢原子异常碳容量，显示很强的供质子能力[12]。另外，其还可以通过将自由基转化为以前的产物来终止自由基链式反应使其拥有更好的抗氧化活性[13]。为了充分利用蛋黄果的营养成分，分析乙酰化蛋黄果多糖的抗氧化活性，通过对蛋黄果多糖提取与乙酰化取代度分析，寻找具有优良抗氧化活性的乙酰化多糖结构，更好地开发利用海南蛋黄果资源，提升产品的利用度，挖掘新型食品抗氧化剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料与试剂 蛋黄果购于海南省海口市水果市场，成熟度相近的果实。

无水乙醇、石油醚、三氯乙酸、乙酸酐、盐酸、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；ABTS、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（美国Sigma公司）；水杨酸，广州化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备 冷冻干燥机，LGJ-10，北京四环科学仪器厂有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9070A，上海申贤恒温设备厂；超声波清洗仪，XO-5200DTS，南京先欧仪器制造有限公司；数显恒温水浴锅，HH-1，江苏智博瑞仪器制造有限公司；循环水式多用真空泵，SHZ-D（Ⅲ），河南省予华仪器有限公司；旋转蒸发器，RE-52A，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，TP-214，丹佛仪器（北京）有限公司；恒流泵，HL-2D，上海青浦沪西仪器公司；红外光谱仪，Nicolet 6700，美国；双光束紫外分光光度计，TU-1901，北京普析通用仪器有限公司；高速离心机，LGJ-10，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋黄果多糖提取工艺 （1）蛋黄果样品预处理。蛋黄果去除果皮，分开种子和果肉，并将果肉打浆，放在50℃烘干箱内烘干12 h。随后将足够干燥的蛋黄果果肉粉碎，通过60目筛网，采用石油醚连续提取法脱脂，运用乙醇溶液（99.5%）浸透48 h除杂，烘干处理，最后放置在干燥器中予以备用。

（2）蛋黄果多糖提取。根据马金爽等[5]的超声波辅助法方法提取蛋黄果多糖。采用蒸馏水为提取剂，称取5.0 g蛋黄果果肉粉末置于锥形瓶内，超声提取，然后4000 r/min离心15 min，过滤，接着用旋转蒸发器浓缩到5/1，添加4倍浓缩溶液体积的乙醇溶液（99.5%），放置在4℃环境下静置12 h，减压过滤、冷冻干燥得蛋黄果的果肉粗多糖[14]。

（3）蛋黄果多糖的除蛋白。蛋黄果粗多糖含有蛋白质，采用三氯乙酸在低温条件下使蛋白质变性析出，除去蛋黄果多糖中的蛋白质。将上述得到的蛋黄果粗多糖溶解于蒸馏水，并置于冰浴中，加入预先配置的15%三氯乙酸溶液，边加入边搅拌使溶液的pH为2～3，4℃下保持1h。将除蛋白的溶液取出，离心15 min，收集上清液，浓缩、添加4倍浓缩溶液体积的乙醇（99.5%）放置在4℃静置12 h，减压过滤、冷藏干燥得蛋黄果果肉除蛋白粗多糖，命名为DHG[15]。

1.2.2 蛋黄果多糖乙酰化修饰与取代度测定（1）乙酰化蛋黄果多糖制备。以蛋黄果多糖为原料，通过探索蛋黄果多糖的抗氧化活性效果，结合多糖乙酰化反应对蛋黄果多糖进行改性，将改性前后的抗氧化活性进行对比，以期为后续的蛋黄果多糖的研究以及副产物开发提供新的研究思路。

采用乙酸酐法修饰，参考CHEN等[16]的方法稍作修改。称取3份蛋黄果多糖各0.50 g，在搅拌下用20 mL蒸馏水充分溶解，用20%NaOH溶液将pH调至9.0。将均相溶液在室温下保持10 min，分别加入1、3、5 mL乙酸酐，获得具有不同取代度的乙酰化衍生物。随后向每种混合物中添加20%NaOH，将pH保持在8.0～8.5。30 min后，用20%HCl溶液停止反应，并将pH调节至7.0。将所得溶液用离子水透析48 h（透析袋MW 3500），浓缩，醇沉，抽滤，冷冻，干燥得3种乙酰化蛋黄果多糖，即DHG-Ac1（1 mL醋酐）、DHG-Ac2（3 mL醋酐）和DHG-Ac3（5 mL醋酐）。

（2）蛋黄果多糖乙酰化取代度（）测定。参考SÁNCHEZ-RIVERA等[17]的方法。将20 mg Ac-DHG1-3溶于10 mL 20%NaOH溶液中，在50℃下搅拌2 h。以酚酞为指示剂，用20%HCl溶液滴定过量的NaOH。乙酰基含量（, %）按公式（1）计算，DHG为对照组。

草害采取药剂化除与人工除草相结合的办法。一般在播后苗前，要趁雨后抢墒，亩用96%金都尔乳油60-70 mL兑水50 kg，均匀喷于土表；在苗期单子叶杂草5-6叶前，亩用25%盖草能乳油40-50 mL加水30 kg，喷于杂草茎叶上，有很好的防除效果。

式中，0为NaOH的体积，mL；0为NaOH的浓度，mol/L；1代表HCl的体积，mL；1为HCl的浓度，mol/L；是样品质量，mg。

1.2.3 红外光谱（IR）分析 取适量待测的蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖样品与干燥后的KBr粉末充分混合均匀后，放置于研钵内研磨、压片，以空气为空白参照，在波长4000～400 cm‒1下对样品扫描。

1.2.4 扫描电镜（SEM）分析 取适量待测的蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖样品置于真空喷镀仪内喷金，室温条件下进行电镜扫描。

1.2.5 抗氧化活性测试 （1）DPPH自由基清除能力的测定。参照BRAND-WILLIAMS等[18]的方法。采用抗坏血酸作对照。配制DPPH乙醇溶液（1 mmol/L），将DPPH溶液和多次准确量取的2 mL多种质量浓度的样品溶液均匀混合，在25℃暗处放置30 min，随后记录下517 nm处的吸光度值，并计算其清除率。

（2）ABTS自由基清除能力的测定。参考RE等[19]的方法。用无水乙醇配置在734 nm下吸光度为0.7的ABTS溶液。配置待测溶液，室温下反应6 min，在734 nm下测量其吸光度值，用抗坏血酸作对照，计算清除率。

（3）OH自由基清除能力的测定。根据SMIRNOFF等[20]的方法。配置H2O2、FeSO4和水杨酸溶液，浓度均为6 mmol/L。配置待测溶液，混匀，避光在37℃水浴反应1 h。在520 nm处测量吸光度，计算清除率。用抗坏血酸作对照。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据统计；采用SPSS 23.0软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 取代度分析

乙酰化多糖不同取代度往往决定着乙酰化多糖的理化性质和生物活性。取代度通常是指多糖的每个D-葡萄糖单元上的活性羟基被取代的物质的量。本研究选择3种取代度乙酰化多糖，分别命名为DHG-Ac1、DHG-Ac 2、DHG-Ac 3，进一步研究其抗氧化活性，结果见表1。当乙酸酐用量分别为1、3、5 mL时，制备得到的乙酰化多糖取代度分别是0.237±0.05、0.275±0.07、0.228± 0.04。由表1可看出，当乙酸酐∶蛋黄果多糖=6.48± 0.02时，蛋黄果多糖乙酰化的取代度最大，为0.275±0.07。

表1 不同乙酸酐体积对取代度的影响

注：*表示不同处理间差异差异（<0.05）。

Note:*represents significant difference between different treatments (<0.05).

2.2 结构分析

蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖DHG-Ac2的红外谱图如图1所示。乙酰化蛋黄果多糖的红外光谱显示了3417 cm–1（–OH）、2950 cm–1（–CH）处的伸缩振动和1636 cm–1处的（–OH）转动振动，由此可知，乙酰化反应并没有影响蛋黄果多糖的基本结构。不同的是乙酰化蛋黄果多糖在1738 cm–1处有酯基C=O的伸缩振动吸收峰，而在蛋黄果多糖红外光谱中没有出现，表明其乙酰化成功。

图1 蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖红外光谱图

蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖的扫描电镜图如图2所示。未经乙酰化的蛋黄果多糖表面相对光滑平整，呈片状结构。乙酰化后的蛋黄果多糖表面形状不规则，出现很多空隙并且表面粗糙。

A：蛋黄果多糖；B：乙酰化蛋黄果多糖。

2.3 抗氧化活性对比分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，其自由基在517 nm处有强吸收的单电子，使其醇溶液显示出紫色的特征。自由基清除剂和单电子配对时，吸收效果逐渐消失，配对电子数量和褪色变化具有定量关系[21]。图3结果显示，Vc、蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖对DPPH都有较好的清除效果。整体DPPH自由基清除能力表现为，Vc>乙酰化蛋黄果多糖>蛋黄果多糖，其清除率随样品浓度逐步增加而趋于稳定。且3种乙酰化蛋黄果多糖中DHG-Ac2（3 mL醋酐）清除效果最好，在1.0 mg/mL时，清除能力达91.37%，高出蛋黄果多糖DPPH自由基清除能力10%左右。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 ABTS自由基能够被抗氧化剂提供的电子或氢原子灭活，导致溶液颜色变化，通过颜色变化检测其物质的抗氧化活性[22]。图4结果显示，整体ABTS自由基清除能力为Vc>乙酰化蛋黄果多糖>蛋黄果多糖，其随浓度升高而增加。同浓度下，清除率由高到低依次是Vc、DHG-Ac2（3 mL醋酐）、DHG-Ac3（5 mL醋酐）、DHG-Ac1（1 mL醋酐），最低为蛋黄果多糖。乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖ABTS自由基最高清除率分别为58.73%和40.86%。说明通过乙酰化修饰后的蛋黄果多糖ABTS自由基清除率得到了提升，提高了43.7%。

图3 乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖DPPH自由基清除能力

图4 乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖ABTS自由基清除能力

2.3.3 OH自由基清除能力 OH在机体内氧化能力很强，当羟基自由基过量产生时，机体内的氧化反应系统动态平衡被破化，导致很多疾病的发生，故要对羟基自由基进行清除。图5结果显示，整体OH自由基清除能力为Vc>乙酰化蛋黄果多糖>蛋黄果多糖，其随浓度升高而增加。DHG-Ac1（1 mL醋酐）和DHG-Ac3（5 mL醋酐）的消除率基本无差别。乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖浓度在1.0 mg/mL时清除率达最高，分别为56.36%和44.97%。本研究中乙酰化蛋黄果多糖OH自由基清除能力高于蛋黄果多糖25.3%。

图5 乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖OH自由基清除能力

以上结果均表明，蛋黄果多糖具有一定的抗氧化活性，经乙酰化改性后的蛋黄果多糖，抗氧化性能力提高。

3 讨论

植物多糖由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成，其拥有多种生物活性。许多研究发现，蛋黄果多糖具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗癌、免疫调节、抗疲劳、维持肠道稳态保护肝脏、抗病毒、降血糖等多种生物活性。蛋黄果多糖显示较好的清除自由基能力、抑制脂质过氧化作用以及提高谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性等。将乙酰基接入蛋黄果多糖支链，改变多糖分子的横向次序和定向性，增强多糖的表面粗糙性和溶水性。乙酰基活化异头碳的氢原子的程度越高，基团的激活能力越强，氢衍生物的原子贡献能力越强，表现出的抗氧活性越强。

乙酰化蛋黄果多糖的DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基的清除能力测定结果表明：在浓度为1.0 mg/mL时，乙酰化蛋黄果多糖中DHG-Ac2（3 mL醋酐）的DPPH清除能力、ABTS自由基清除率、OH自由基清除率分别为91.37%、58.73%、56.36%，高于蛋黄果多糖10%、43.7%、25.3%。这说明乙酰化蛋黄果多糖提高了蛋黄果果肉的抗氧化性，与LI等[23]、蔡婉静等[24]的研究结果相符。乙酰化蛋黄果多糖和蛋黄果多糖在清除DPPH自由基方面表现显著，这与蛋黄果多糖的疏水性有关。乙酰基团的引入可以提高蛋黄果多糖对ABTS自由基和OH的清除能力，主要由于多糖溶解性的改善导致抗氧化能力的提升。与王警等[25]、马波等[26]、WANG等[27]的研究结果相符，即与乙酰龙眼肉多糖、辣木多糖、龙须菜多糖对OH自由基的清除能力一致。

取代度（D）是蛋黄果乙酰化修饰产物重要参数之一，本研究在碱性条件下，添加1、3、5 mL乙酸酐于蛋黄果多糖中，室温反应得到3种取代度（0.237±0.05、0.275±0.07、0.228±0.04）的乙酰化蛋黄果果肉多糖。WANG等[28-31]在实验中虽然增加乙酸酐添加量，但取代度呈先升高后趋于平缓下降的趋势，并且抗氧化活性随着取代度的增加而增加，这与本研究结果相符合。推测较高的取代度引起多糖抗氧化能力的提高，这可能是引入的乙酰基能活化多糖链中的异头碳，使得多糖的供氢能力提升，继而提升乙酰化蛋黄果多糖的抗氧化作用[27]。

蛋黄果多糖和乙酰化蛋黄果多糖的红外光谱显示了3417 cm–1（–OH）、2950 cm–1（–CH）处的伸缩振动和1636 cm–1处的（–OH）转动振动，表明乙酰化反应没有影响蛋黄果多糖基本结构。本研究分析了D=0.275±0.07的乙酰化蛋黄果多糖在1738 cm–1酯基C=O的伸缩振动吸收峰，表明乙酰化修饰后多糖出现了酯基中C=O的振动吸收峰，实验也显示较低乙酰化度的蛋黄果多糖的红外光谱在酯基C=O的伸缩振动吸收峰处表现不明显。

从形貌特征观察，蛋黄果多糖表面相对光滑平整，呈片状结构，这是大多数植物多糖的特征[32-34]，但乙酰化修饰多糖的分子间交联增强，构象发生了变化[35]，呈现表面形状不规则、粗糙，多空隙，形貌的改变促进了抗氧化性的提升。

综上，通过乙酰化修饰可以改善多糖结构，增加溶解性和表面粗糙度，改变了供氢能力可以提高其抗氧活性。相信随着对蛋黄果多糖乙酰化修饰方法研究的进一步深入，可以进一步阐明乙酰化蛋黄果多糖的抗氧化活性机制。

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AcetylatedPolysaccharide and Its Antioxidant Activity

JIA Penghe1,TIAN Yinan1, XU Xiaojun1, ZENG Sijie2, YANG Dingguo3, HAN Changri3, LIU Hong1,2*

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Haikou, Hainan 571158, China; 2. Haikou Key Laboratory of Research and Development on Topical and Special Medicine and Edible Plant, Haikou, Hainan 571158, China; 3. Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources of Hainan Province, Haikou Institute of Science and Technology, Haikou, Hainan 571126, China

The antioxidant activity of the acetylated polysaccharides ofis better than that of unmodified polysaccharide. The reasons for the improvement of antioxidant activity of acetylated polysaccharides ofwere analyzed by degrees of acetyl substitution, infrared spectra and morphological characterization. Thepolysaccharide was extracted using the ultrasonic-assisted method, and the protein was removed by the trichloroacetic acid method. 0.50 g of thepolysaccharide was dissolved in 20% NaOH solution, then 1 mL, 3 mL and 5 mL of acetic anhydride were added respectively to obtain three degrees of substitution (0.237±0.014, 0.275±0.011 and 0.228±0.012) of acetylated polysaccharides. The scavenging effects were evaluated by DPPH free radical, OH radical and ABTS radical. The degree of acetyl substitution of polysaccharides increased significantly at first, then decreased gently with addition of acetic anhydride. The infrared spectra of the acetylated polysaccharides showed a stretching vibration of 3417 cm–1hydroxyl (–OH), 2950 cm–1methylene (–CH), 1636 cm–1hydroxyl (–OH) rotational vibration, and 1738 cm–1C=O stretching vibration, indicating that acetylation was successfully connected. The results of scanning electron microscope showed that the surface of theoriginal polysaccharides was relatively smooth and flat. As for acetylated polysaccharides, the intermolecular crosslinking was enhanced, the conformation was changed, and the surface shape became irregular and rough. Among the three acetylated polysaccharides, DHG-Ac2 (3 mL acetic anhydride) had the best scavenging effect. At the concentration of 1.0 mg/mL, the DPPH scavenging capacity, ABTS radical scavenging rate and OH radical scavenging rate was 91.37%, 58.73% and 56.36% respectively, which was higher than 10.0%, 43.7% and 25.3% of the original polysaccharides. The introduced acetyl group could activate the heterocephalic carbon in the polysaccharide chain to improve the hydrogen supply capacity of the polysaccharides, and then to enhance the antioxidant effect. This study would provide basic research data for further development and application of the polysaccharides of

aetylated polysaccharide; structural modifications; antioxidant activity;

Q539

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.09.014

2021-12-14；

2022-03-07

海口市重点科技计划项目（No. 2021-034）。

贾朋贺（1998—），男，硕士研究生，研究方向：植物化学。*通信作者（Corresponding author）：刘 红（LIU Hong），E-mail：lh@hainnu.edu.cn。