臭氧杀菌技术在肉制品原料处理中的研究与应用

孙晓红，王迎迎，李 洋，辛伟娟，史丽新，曹福红，苏鲁滨

（烟台喜旺肉类食品有限公司，山东 烟台 264000）

肉及肉制品是人体营养的主要来源，能为人类提供必需营养素。社会生活中，肉制品的数量和质量已成为衡量人民生活质量的重要指标之一。随着经济社会的发展和进步，消费者的观点得到更新，口感、营养、健康已成为广大居民的第一选择，因此低温肉制品以其结实的肉质、富有弹性的结构、最大程度保留肉类的营养等特点，越来越受到广大消费者的欢迎[1]。但是，低温肉制品储存不当极易变质。因此，为了确保低温肉制品的食品安全，需要从源头开始控制微生物。采取对入厂的原料、辅料、包材进行消毒、杀菌，生产过程严格控制卫生，对终产品进行杀菌等方式。目前，生产过程控制、产品杀菌都有成型的方式方法进行应用，而对原料的消杀大部分为二氧化氯浸泡，二氧化氯消毒后有残留，长期使用会对人体产生伤害。随着社会的发展进步，人们对食品安全越来越重视，在加工食品过程中选择安全无残留的能源，是大势所趋。臭氧杀菌就是一种安全无残留的杀菌方式，完美契合了我国食品加工业营养健康、安全环保的发展主题。

臭氧具有强氧化性[2]，通过生物化学氧化反应实现灭菌，臭氧分解产生新生氧的氧化能力实现杀菌。臭氧会自行分解为氧气，不产生残留污染，消毒后不需通风换气，可用作杀菌或防霉保鲜直接对食品使用，简单方便。臭氧有效杀菌浓度对食品而言是极微弱的浓度，对食品无害。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冻猪肉，德州金锣肉制品有限公司提供；平板计数琼脂，北京陆桥技术股份有限公司提供；三氯乙酸、盐酸、甲基红、亚甲基蓝等，国药集团化学试剂北京有限公司提供。

PL-2001-L 型电子天平，梅特勒- 托利多仪器（上海） 有限公司产品；HPX-9162MBE 型电热恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；TU-1810D 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；德拉瓦伊解冻设备，上海德拉瓦伊食品机械贸易有限公司产品；臭氧发生器，济南瑞清臭氧设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

（1） 臭氧质量浓度对杀菌效果的影响。将拆箱后的冷冻猪肉放入德拉瓦伊设备中，按设备要求摆放在解冻架上，设备参数设置为17 ℃，待肉的中心温度达到-5～0 ℃时，开始进行臭氧杀菌。每次测定重复3 次，取平均值。

臭氧试验分组见表1。

表1 臭氧试验分组

（2） 杀菌时间对臭氧杀菌效果的影响。将拆箱后的冷冻肉放入德拉瓦伊设备的解冻架上，设备参数设置为17 ℃，待肉的中心温度达到-5～0 ℃时，开始进行臭氧杀菌，臭氧质量浓度设为6 mg/L，杀菌时间分别为1.0，1.5，2.0 h，杀菌后取出进行指标测定。每次测定重复3 次，取平均值，同时做对照试验。

（3） 杀菌温度对臭氧杀菌效果的影响。将拆箱后的冷冻肉放入德拉瓦伊设备的解冻架上，德拉瓦依设备温度分别设置为10，17，25 ℃，湿度控制在90%，待肉的中心温度达到-5～0 ℃时，开始进行臭氧杀菌，臭氧质量浓度设为6 mg/L，杀菌时间设为1.5 h。杀菌后进行指标测定，每次测定重复3 次，取平均值，同时做对照试验。

1.2.2 正交法确定杀菌参数

在对臭氧质量浓度、杀菌时间、杀菌温度进行单因素试验的基础上，使用正交设计优化三因素三水平得到最优组合，以菌落总数、蛋白羰基含量、TBARS 为评价指标进行分析。

臭氧杀菌关键参数确定正交试验因素水平见表2。

表2 臭氧杀菌关键参数确定正交试验因素水平

1.2.3 菌落总数的测定

参照GB/T 4789.2-2016 进行测定。

1.2.4 蛋白羰基含量的测定

根据Soglia F 等人[3]的方法进行修改。猪肉样品搅碎，取1 g 样品，加入0.15 mol/L 冰浴KCl 溶液10 mL，以转速 3 000 r/min 均质 60 s，取 100 μL 的均质液2 份，分别加入200 g/L 三氯乙酸溶液1 mL，以转速5 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，加入50 g/L 十二烷基磺酸钠溶液400 μL，2 份混合样品同时超声60 min，一份样品加入含质量浓度为2 g/L的2,4- 二硝基苯肼（DNPH），另一份只加入2 mol/L的 HCl 溶液 800 μL 做空白。放置 30 min，加入400 g/L 三氯乙酸溶液400 μL，以转速5 000 r/min离心5 min。移除上清液，加入体积比为1∶1 的乙醇- 乙酸乙酯混合液1 mL，以转速10 000 r/min离心5 min。重复操作3 次后，在沉淀中加入pH 值6.5、含有 6 mol/L 的盐酸胍的 20 mmol/L 的 NaH2PO4溶液1.5 mL，蛋白质溶解后，于4 ℃条件下放置12 h，于波长280 nm 和370 nm 处分别测定吸光度。

1.2.5 脂质过氧化（TBARS） 的测定

参照Klaenhammer T R[4]略作修改。肉样搅碎，称取10 g，加入50 mL 含0.1%EDTA 的7.5%三氯乙酸，振摇30 min，过滤，取上清液5 mL，加入0.02 mol/L TBA 5 mL，沸水浴加热40 min，取出冷却，以转速4 000 r/min 离心20 min ，取上清液，加入5 mL 氯仿，摇匀，静置分层，取上清液，在波长532 nm 处测比色。计算公式如下：

式中：A532——待测液在波长532 nm 下的吸光度；

Ws——样品的质量，g。

1.2.6 感官品质评定[5]

依据《GB 2726 食品安全国家标准熟肉制品》，选取10 名人员按照表3 产品进行评价，汇总数据，进行统计分析。

产品感官评分项目与评分标准见表3。

表3 产品感官评分项目与评分标准

1.2.7 保质期的测定

将臭氧杀菌技术进行了3 次试验验证，采用臭氧杀菌技术、正常工艺生产的冷切肠，各取500 袋，分别置于25 ℃下进行恒温培养。每20 d 检测1 次菌落总数，同时进行感官检验。菌落总数检验值达到103CFU/g 或产品感官变质率达到1%时，结束恒温培养。

1.3 数据处理

试验中数据均重复3 次，使用IBM SPSS Statistics 26 软件进行统计分析，当p＜0.05 时，认为组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 臭氧质量浓度对杀菌效果的影响

臭氧质量浓度对菌落总数的影响（*p＜0.05） 见图1。

图1 臭氧质量浓度对菌落总数的影响（*p＜0.05）

由图1 可知，第1 组与对照组的菌落总数变化差异不显著（p＞0.05），第2，3，4 组与对照组相比杀菌效果显著（p＜0.05），但是第2，3，4 组间差异不显著（p＞0.05），这是因为臭氧杀菌只能对猪肉表面进行杀菌，猪肉内部的细菌依然存活。臭氧化学性质活泼具有极强的氧化能力，可以同细菌的细胞壁中存在的蛋白质等有机物发生化学反应，使细胞壁通透性增加，细胞内容物流出，使其失去活性[6]。臭氧破坏或分解细胞壁迅速扩散进入细胞里氧化了细胞内酶或RNA、DNA从而致死菌原体[7]。因臭氧具有强氧化性，导致在杀菌过程原料肉的蛋白羰基含量、TBARS 明显升高[8]。

臭氧质量浓度对蛋白氧化的影响见图2，臭氧质量浓度对脂质氧化的影响见图3。

图2 臭氧质量浓度对蛋白氧化的影响

图3 臭氧质量浓度对脂质氧化的影响

2.1.2 臭氧杀菌时间对杀菌效果的影响

杀菌时间对杀菌效果的影响见图4。

由图4 可知，臭氧杀菌的效果显著（p＜0.05），杀菌时间越长，杀灭的菌落越少。但随着杀菌时间的延长，蛋白氧化、脂质氧化程度越来越高，杀菌1.5 h与2.0 h，蛋白氧化、脂质氧化差异不显著（p＞0.05）。

图4 杀菌时间对杀菌效果的影响

2.1.3 杀菌温度对臭氧杀菌效果的影响

杀菌温度对杀菌效果的影响见图5。

图5 杀菌温度对杀菌效果的影响

臭氧的杀菌效果受温度影响较大，由图5 可知，随着杀菌温度的升高，菌落总数数值逐渐升高，低温时微生物的杀灭效果较好，10 ℃杀菌后菌落总数为3.62±0.06 lg CFU/g， 17 ℃杀菌后的菌落总数为3.85±0.05 lg CFU/g，25 ℃杀菌后的菌落总数为3.80±0.08 lg CFU/g。此外，随着杀菌温度的升高，蛋白氧化、脂质氧化的速度也在加快。

2.2 正交试验法确定杀菌参数

正交试验结果见表4。

表4 正交试验结果

通过对臭氧质量浓度、杀菌时间和杀菌温度进行单因素试验，使用三因素三水平正交设计优化得到最优组合。在贮藏期间，通过菌落总数、蛋白羰基含量与TBARS 进行分析。根据表5 各指标的值确定各因素的最优水平组合为菌落总数A3B2C1，蛋白羰基含量A1B1C1，TBARS A1B1C1。由于各项指标分析得到的最优组合均不一致，考虑到对产品品质影响较大的因素为菌落总数，而国家标准对蛋白羰基含量与TBARS 未作规定，经综合平衡分析，得到最优组合为A3B2C1，即臭氧质量浓度8 mg/L，杀菌时间1.5 h，杀菌温度10 ℃。

后期对最优组合的进行效果验证过程中发现，杀菌质量浓度为8 mg/L 时，会使产品中带有一些令人不悦的气味，这可能与臭氧自身带有的特殊气味有关。原料肉正常的解冻温度为17 ℃，解冻后需将温度调整为10 ℃进行臭氧杀菌，操作比较繁琐，耗费时间较长。因此，结合实际应用情况，对最优组合的参数进行调整为臭氧质量浓度6 mg/L，杀菌时间1.5 h，杀菌温度17 ℃。

2.3 臭氧杀菌技术的验证

2.3.1 臭氧杀菌技术对产品感官评分的影响

产品存放过程感官评分的变化情况见图6。

图6 产品存放过程感官评分的变化情况

由图6 可知，臭氧杀菌技术与对照产品感官评分均随着存放时间的延长而下降，总体来看，臭氧杀菌技术的产品感官好于对照产品。存放0，15，30 d的感官评分，二者无显著差别（p＞0.05），说明应用臭氧杀菌技术处理原料肉对产品感官影响不大。45 d以后，对照产品的感官评分下降趋势明显，至75 d时，臭氧杀菌技术的产品评分明显高于对照产品（p＜0.05）。由此可见，臭氧处理原料肉在一定程度上能保持冷切肠的感官品质。

2.3.2 臭氧杀菌技术对产品保质期的影响

臭氧杀菌技术对保质期的影响见图7。

图7 臭氧杀菌技术对保质期的影响

由图7 可知，臭氧杀菌的产品25 ℃保质期可以达到90 d，而对照产品的保质期为75 d，臭氧杀菌能够使产品保质期延长20%。

2.3.3 臭氧杀菌技术对产品脂质过氧化的影响

产品存放过程TBARS 的变化情况见图8。

图8 产品存放过程TBARS 的变化情况

由图8 可知，臭氧杀菌产品的TBARS 值高于对照产品，其脂质过氧化的问题可在后期通过改进包装形式等方式进行调整。

3 结论

通过单因素试验获得了臭氧杀菌的最优组合，结合实际应用，最优组合为臭氧质量浓度6 mg/L，杀菌时间1.5 h，杀菌温度17 ℃。臭氧杀菌技术的验证过程中，冷切肠存放至75 d 时，感官评分为86.7±0.08 分，均显著优于对照组 （p＜0.05）；而TBARS 则高于对照组。结果表明，臭氧杀菌处理原料肉能有效抑制产品腐败变质，但是如何延缓产品脂质氧化方面，需要继续进行研究。