鸭疫里默氏杆菌商丘流行株的分离鉴定及耐药性分析

刘传辉 ， 韩 楠

(1.商丘市畜产品质量监测检验中心 ， 河南 商丘 467000 ； 2.鹤壁市农产品检验检测中心 ， 河南 鹤壁 458000)

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的一种急性、接触性传染病，主要感染2～8周龄的雏鸭、雏鹅等水禽动物。主要表现为肝周炎、纤维素性心包炎、脑膜炎和气囊炎病理特点[1]。1982年我国首次分离鉴定出RA[2]，病死率较高。RA在自然界广泛存在，国际上公认RA有21个血清型，其中1型和2型为优势血清型，不同血清型之间没有交叉免疫保护，不同地区分离的菌株血清型也不尽相同，存在较大差异[3]。再加上兽医临床治疗中抗菌药物的盲目或者超剂量使用，导致细菌耐药性非常严重，给该病的预防和治疗造成很大困难。目前，鸭疫里默氏杆菌病是严重危害养鸭业、养鹅业的重要细菌性传染病之一。本试验从商丘市某养鸭场病鸭中分离出6株RA，感染病鸭均为15日龄左右，病理剖检病死鸭均出现纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎和脾肿大等相同的病变，并对6株RA进行了生物特性、耐药性和致病性试验，以期为商丘市鸭疫里默氏杆菌病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 疑似感染RA的15日龄左右病死鸭来自商丘市不同县(市、区)的养鸭场，剖检均可见纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎病理特点。采集病死鸭的脑、心脏、肝脏和脾脏等病料，共28份。12只7日龄健康雏鸭，由商丘市绿都生态养殖有限公司提供。

1.2 主要试剂 巧克力琼脂培养基、胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(含5%胎牛血清)(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、LB培养基和麦康凯培养基，均由商丘市动物疫病控制中心实验室自制。30%甘油保菌液、革兰染液、瑞氏染液、微量生化鉴定管和药敏试纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。鸭疫里默氏杆菌1、2型菌株和标准血清，均由河南农业大学提供。细菌基因组DNA提取试剂盒、Goldview核酸染料，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Mix和琼脂糖，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 细菌分离与培养 无菌采取病死鸭的脑组织、肝脏、心包积液，分别接种于巧克力琼脂培养基和TSA培养基，置于烛缸中37 ℃恒温箱培养 24～48 h，观察细菌生长情况、菌落特征。分别挑取透明、露珠状、边缘光滑的菌落在LB培养基上进行传代纯培养，革兰染色和瑞氏染色，在显微镜下观察菌体染色特性和形态。

1.4 细菌生化鉴定 将纯化的单个细菌菌落接种于葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、硫化氢、尿素、氧化酶和枸橼酸盐等细菌生化微量鉴定管中，置烛缸内37 ℃恒温培养24 ～48 h，观察记录结果。

1.5 PCR鉴定 无菌吸取1 mL分离菌纯培养物，加入100 μL PBS 溶液，经过水浴、离心处理后取上清液为 DNA 模板，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取细菌总DNA。采用细菌16S rRNA基因通用引物进行分离菌株的PCR扩增。上游引物：16S(F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG- 3′，下游引物：16S(R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3′，预期扩增片段长度约为1 450 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增反应体系(25 μL)：模板 DNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，最后加灭菌ddH2O补至25 μL。PCR反应参数：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共30个循环；72 ℃再延伸5 min。取40 μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带回收DNA凝胶纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果输入NCBI网站中，选取参考菌株的16S rRNA 基因序列，拼接后利用MegAlign 软件对分离菌进行同源性比对。

1.6 血清型鉴定 将鉴定为RA的分离菌接种于TSB培养基，待长出单菌落之后，挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，振荡培养12 h后，将菌液离心3次，用PBS将菌体重悬，作为RA分离株玻片凝集抗原。参照黄美玲等[4]报道的平板凝集试验方法，对分离菌株进行血清型鉴定。分别以对应血清型的阳性菌株作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照、PBS作为空白对照，鉴定RA血清型。结果判定标准：菌液与血清混合后3 min内不出现颗粒状凝集者为阴性，出现颗粒状凝集者为阳性。

1.7 药敏试验 采用纸片扩散法(K-B)，挑取单个纯培养菌落接种于TSB(含5%胎牛血清)，37 ℃培养24 h，生理盐水调制菌液浓度为0.5个麦氏标准比浊管，然后吸取100 μL菌液均匀涂布在巧克力平板表面，待平板干燥后，无菌取药敏纸片贴于巧克力琼脂平板上，37 ℃孵育18～24 h，利用游标卡尺量取抑菌圈直径。结果判定参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)发布的抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI—2017)。

1.8 动物回归试验 将12只健康雏鸭随机分为试验组和对照组，每组6只。选取已鉴定的RA分离菌株接种巧克力琼脂平板培养基，37 ℃培养24 h，生理盐水调制菌液浓度为2.0×108CFU/mL。试验组腿部肌内注射RA分离菌液，0.5 mL/只，对照组腿部肌内注射生理盐水，0.5 mL/只。观察并记录雏鸭临床症状。

2 结果

2.1 分离菌培养特性和形态特征 从28份病料中分离出6株疑似RA细菌，分别命名为SQ-RA1、SQ-RA2、SQ-RA3、SQ-RA4、SQ-RA5和SQ-RA6。细菌分离培养结果见图1，分离株在巧克力平板培养基和TSA琼脂平板上菌落微隆起、边缘整齐、透明、呈露珠状；分离菌革兰染色镜检呈阴性短小杆菌，无芽孢，两端钝圆，多数单个存在，少数成对或链状排列，长度为(0.2～0.4)μm×(1～5) μm；分离菌瑞氏染色镜检，呈菌体两极浓染。符合鸭疫里默氏杆菌的形态特征。

图1 分离菌显微镜观察Fig.1 Microscopic observation of isolated strains A：分离菌在巧克力培养基上的菌落形态； B:革兰染色(400×)A:Colony morphology of isolated strains on chocolate medium； B:Gram staining (400×)

2.2 生化鉴定 6株分离菌均不发酵葡萄糖、蔗糖和麦芽糖；V-P试验、甲基红试验、硫化氢产生、甘露醇、硝酸盐还原和枸橼酸盐试验均为阴性；其中2株分离菌对氧化酶、触酶和尿素试验均为阳性。根据细菌形态学特征和生化特性试验结果，6株分离菌可初步鉴定为RA。

2.3 PCR鉴定 琼脂糖凝胶电泳成像结果显示，6株分离菌的扩增片段大小均在1 450 bp左右(图2)，与预期大小相符。测序比对结果显示，分离菌与NCBI基因库 BLAST 中的RA参考菌的16S rRNA基因序列同源性为99.4%～100.0%，均高于97.0%。结合参考文献[5]的报道,分离菌的16S rRNA基因序列同源性为97.0%～98.9%时，可判定为同属，同源性高于99.0%时，可判定为同种。因此，PCR鉴定结果确定6株分离菌均为RA。

图2 16S rRNA基因的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:DL-2 000 Marker； 1～6:分离菌株M:DL-2 000 Marker; 1- 6:Isolated strains

2.4 血清型鉴定 经鉴定，SQ-RA1、SQ-RA3为血清1型，SQ-RA2、SQ-RA5和SQ-RA6为血清2型，SQ-RA4为未定血清型菌株。

2.5 药敏试验 6株分离菌的药敏试验结果见表1。6株分离菌对羧苄西林、氨苄西林、庆大霉素、链霉素、多西环素、头孢氨苄6种药物高度耐药，耐药率均大于80%，对复方新诺明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林7种药物高度敏感。

表1 分离菌株的药敏试验Table 1 Drug sensitivity test of isolated strains

续表

2.6 动物回归试验 试验组雏鸭在攻毒8 h内，部分雏鸭临床表现精神不振，卧地嗜睡，站立不稳；12 h内，雏鸭食欲下降或废绝，眼鼻流出黏性分泌物，腹泻；24 h内，雏鸭表现神经症状，角弓反张，双腿麻痹，走路摇晃，并有5只雏鸭死亡，第3天试验雏鸭全部死亡。剖检死亡雏鸭可见心包、胸腔积液增多，纤维素性心包炎，肝脏肿大，有纤维性渗出物覆盖表面，脾脏出现大理石样花纹，纤维素性气囊炎等，与鸭疫里默氏杆菌病的病理特征一致。无菌采集心脏、肝脏、脾脏等病料做细菌分离培养鉴定，结果分离出与自然分离株相一致的RA。对照组雏鸭正常，未见上述临床症状。动物攻毒试验表明，血清1型、2型和未知型分离菌均有很强的致病性。

3 讨论

鸭疫里默杆菌对鸭、鹅等水禽养殖业危害严重，其血清型众多，据朱晓霞等[6]报道,我国主要有18个血清型，其中1～5型血清型分布最为广泛。不同地区的RA菌株不同，即便同一地区的养殖场，血清型种类也有所差别。周英宁等[7]报道，广西地区主要流行株为血清1型和血清2型；陈宏智等[8]调查河南省信阳地区鸭疫里默氏杆菌病流行情况，发现以血清1型、2型和3型为主；王卓昊等[9]研究发现，苏北及周边地区优势血清型为1型和未定型血清型，并且在一定时期同一地呈现多菌株多血清型流行的特点。本试验通过细菌分离、生化试验、血清型鉴定和PCR鉴定，从商丘不同地区养鸭场疑似感染RA的28份病死鸭中成功分离出6株RA菌株，主要血清型分布为血清1型和2型，分离率为21.43%(6/28)，表明商丘地区RA流行株与以上报道结果基本一致。因此，开展RA血清型调查，摸清当地和场内优势菌株，对准确防控鸭疫里默杆菌病具有重要意义。

文献报道显示，通过不同注射途径感染RA的鸭，其发病率和死亡率差别较大,其中肌内注射发病率和死亡率均达到100%，而腹腔、颈部皮下、脚蹼等其他途径感染RA的发病率和死亡率相对较小[10-12]。因此，肌内注射是评价RA致病力的首选途径。本试验中的动物回归试验选用肌内注射，第3天试验雏鸭全部死亡，证实了肌内注射感染RA，雏鸭的病死率很高，并且血清1型和2型RA致病力很强。

长期以来，RA的防治依靠抗生素，由于临床用药不规范，盲目用药，随意加大剂量，使得RA产生的耐药性不断增加，多重耐药现象也非常普遍，同时，不同地区的分离菌株对抗生素的敏感性存在差别，这给鸭疫里默氏杆菌病的防治带来很大困难。因此，在选用抗生素之前，应先进行药敏试验，根据结果选择敏感的药物，避免因耐药性带来经济损失。本次药敏试验结果显示，RA分离菌对羧苄西林、氨苄西林、庆大霉素、链霉素、多西环素、头孢氨苄6种药物高度耐药，对复方新诺明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林7种药物高度敏感，建议选择敏感药物作为商丘地区临床治疗药物。科学用药，根据本地区、本场的优势血清型，选择免疫原性较好的菌株疫苗开展免疫防治，是有效防控该病的重要途径。