基于网络药理学和分子对接法探索白及三七药对修复糖尿病足的作用机制

颉 玙，张金梅，张 敏，雷 霆

(1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

国际糖尿病联合会预测，全世界大约有4.15亿成年人患有糖尿病，预计到2040年增长为6.42亿[1]。糖尿病足(diabetic foot，DF)作为糖尿病最常见的严重并发症之一，因其复杂的发病机制、巨大的医疗耗资以及难以治愈的临床现状，给患者家庭和社会造成了沉重的负担。西医治疗DF以局部清创、手术修复为主，然而临床疗效不佳。中医药治疗本病历史悠久，中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，其性黏腻、收涩，外能消痈去死肌，内可托溃排脓血，具有托旧生新之妙用[2]。三七是云南白药的重要成分之一，具有祛瘀生新、止血定痛的作用[3]。使用白及三七药对既可托旧生新，又能有效促进溃疡创面愈合，因此对于DF这种慢性难愈性疾病具有良好的修复效果。课题组前期研制的院内制剂“白及胶/微米三七膏”临床疗效得到广大患者的肯定。通过动物实验及对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎性因子的检测，发现此药确有抑制炎症反应的作用[4]，但局限在真实世界研究范畴，目前尚未有系统研究白及、三七治疗DF作用机制的相关报道。本文采用网络药理学及分子对接法筛选出白及三七药对有效成分、作用基因靶点及信号通路，进一步明确其修复机制，为治疗DF提供新的临床思路。

1 资料与方法

1.1白及三七药对化学成分筛选及靶点的获取应用TCMSP数据库、SymMap数据库和BATMAN-TCM数据库检索白及、三七两味中药的所有化学成分及对应靶点。根据TCMSP数据库中药物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)参数，以其中化学成分的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性指数(drug like index，DL)≥0.18和BATMAN-TCM数据库中以靶点分值score≥20作为阈值筛选以上中药化合物[5-7]作为候选化合物。

1.2DF已知治疗靶点和中药-疾病共同靶点的获取 通过毒性与基因比较数据库(CTD)、人类孟德尔遗传研究平台(OMIM)和人类基因信息数据库(GeneCards)搜集DF相关疾病靶点，其中GeneCards数据库以关联系数(Score≥5)作为筛选标准，所得靶点即为DF已知治疗靶点。并将化合物作用靶点与疾病靶点取交集，通过Omicshare进行在线Venn图可视化，获取白及三七药对治疗DF的共有靶点。

1.3构建蛋白质间相互作用网络(PPI) 使用Perl软件(V5.26.3)在Uniprot[8]数据库中为活性化合物对应关键靶点添加基因号及标准化命名，将共有靶点输入String数据库，构建PPI网络图，默认置信度大于0.7，利用可视化软件Cytoscape 3.6.0的cytoHubba插件对网络参数分析，以自由度(Degree)进行网络拓扑分析，筛选出排名前30的Hub基因并绘制蛋白频次条形图。

1.4构建“药物-成分-靶点”网络图 使用Cytoscape 3.6.0软件，将白及三七药物、成分、靶点之间的相互关系进行可视化处理。

1.5白及三七药对治疗DF预测靶点富集分析利用cluster profile R包对核心靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组合百科全书(KEGG)通路分析，GO功能注释包括细胞组分(Cellular Component，CC)、生物学过程(Biological Process，BP)及分子功能(Molecular Function，MF)。KEGG富集分析主要用于分析在行使生物学功能时差异表达基因可能通过的信号通路；其中，以P<0.05值作为筛选指标。

1.6核心活性成分与核心靶点的分子对接 从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nl m.nih.gov/)下载核心活性成分的2D结构，通过ChemOffice软件转化为3D结构并以mol2格式保存。从蛋白质结构(Protein Date Bank，PDB)数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点PDB格式的3D结构，运用PyMOL软件对靶蛋白移除配体和非蛋白分子等操作，利用AutoDock 1.5.6 软件将活性成分及靶蛋白格式转换为pdbqt格式，最后运行Auto dock vina进行分子对接，再使用PyMOL对结果进行可视化处理。

2 结 果

2.1白及三七药对化学成分筛选及靶点的获取将白及、三七两味中药上传至TCMSP、SymMap和BATMAN-TCM数据库，初步检索共得到4 470个活性化合物，按照OB≥30%、DL≥0.18和BATMAN-TCM(score≥20)的标准，进一步筛选出了209个活性化合物，对所有化合物去重并删除无效化合物，最终得到102个活性化合物，其中三七84个、白及18个，共对应1 261个靶基因，见表1。

表1 白及三七药对活性成分

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2.2DF的已知治疗靶点筛选 从OMIM、Genecards、CTD数据库中检索DF相关靶点，从OMIM中检索出52个靶点，由于该数据库中靶点较少，在后续分析中仅用Genecards和CTD数据库筛选得到的交集用于后续分析。CTD中检索到3 726个靶点， Genecards中检索出Score≥5的1 534个靶点，求两者交集得到529个靶点，见图1。

图1 糖尿病足潜在靶点基因

2.3白及三七药对和DF的共有靶点的获取 将疾病靶点与白及三七药对活性成分作用靶点取交集，通过Omicshare进行在线Venn图可视化，可得到共有靶点有164个，见图2及表2。

图2 白及三七药对活性成分-糖尿病足疾病靶点韦恩图

表2 白及三七药对药物-糖尿病足共有靶点

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2.4PPI网络图及核心靶点的筛选 基于String数据库得出164个共有靶点的PPI网络(图3)，再用“cytoHubba”插件对网络参数分析，以自由度(Degree)进行网络拓扑分析后筛选排名前30的Hub基因绘制蛋白频次条形图，这30个靶点相比其他靶点相互作用更强，在PPI网络中起到关键作用，且更可能成为治疗DF的核心靶点(见图4)。

图3 白及三七药对-糖尿病足共有靶点的PPI网络图

图4 白及三七药对-糖尿病足共有靶点排名前30的Hub基因蛋白频次条形图

2.5“药物-成分-靶点”网络图 将药物、成分、靶点导入Cytoscape 3.6.0构建“药物-成分-靶点”网络图(见图5)，共257个节点(药物2个，核心活性成分91个，靶点164个)，723个边。结果显示：Quercetin(槲皮素，Degree=74)、coprine(鬼伞菌素，Degree=26)，Dicapryl Phthalate(邻苯二甲酸二正辛酯，Degree=20)，3,4-Dimethylbenzoic Acid(3,4-二甲基苯甲酸，Degree=20)、Hexadecanoic Acid(棕榈酸，Degree=18)等化合物在整个网络中起重要的作用。

图5 药物-成分-靶点网络图

2.6GO和KEGG通路分析 GO富集分析结果显示，白及三七药对的主要活性成分对应的164个共有靶点，主要涉及细胞因子活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、血红素结合等分子功能；细胞组分方面主要涉及细胞膜、细胞质等；生物过程方面主要涉及脂多糖调节、营养水平的调节、氧化应激反应、活性氧代谢过程等(见图6)。KEGG信号通路分析结果显示，与白及三七药对治疗DF的相关靶标具有显著相关性的信号通路主要有AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等(见图7)，图8为AGE-RAGE通路分析图。

图6 GO功能注释

图7 KEGG 代谢通路图

图8 AGE-RAGE信号通路

2.7分子对接结果 根据“药物-成分-靶点”网络及PPI网络中Degree值可分别得到具有相关性的核心活性成分及其核心作用靶点。对其分析后认为核心活性成分为槲皮素、鬼伞菌素、3,4-二甲基苯甲酸、邻苯二甲酸二正辛酯，核心作用靶点为TNF、TP53、NOS3、IL-6。一般认为结合能小于-4.25kcal/mol提示配体与受体有一定的结合活性，小于-5.0kcal/mol有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol有强烈的结合活性[9]。根据分子对接结果(见表3)，除了邻苯二甲酸二正辛酯与IL-6结合能较高外，槲皮素、鬼伞菌素、3,4-二甲基苯甲酸与其核心靶蛋白结合能均小于-5.0 kcal/mol，说明白及三七药对的核心活性成分与其靶蛋白能形成稳定的结合，同时验证了白及三七药对对DF的确有治疗作用。利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理(见图9)。

表3 白及三七药对主要活性成分-作用靶点分子对接结合能

图9 分子对接模式图

3 讨 论

本次研究主要通过网络药理学及分子对接法预测白及三七药对修复DF的机制，得到了102个主要活性化合物，164个药物-疾病共有靶点，5 597条生物过程和273条信号通路，这些结果能够体现出白及、三七在治疗DF过程中的潜在修复作用机制。

从所得活性成分结果可知，槲皮素、鬼伞菌素、邻苯二甲酸二正辛酯、3,4-二甲基苯甲酸、棕榈酸等成分在“药物-成分-靶点”调控网络中起着重要作用。其中槲皮素具有抗氧化、参与免疫调节及抗炎等作用[10-11]。主要通过提高巨噬细胞的吞噬功能影响细胞因子和炎症介质的分泌[12]，能治疗心血管疾病、糖尿病及癌症等[13-14]。鬼伞菌素是药用菌毛头鬼伞的主要成分，研究证明鬼伞菌素能够通过增加胰岛素的释放，保护胰岛细胞不被入侵，提高抗氧化活性，调节代谢途径，从而起到减少炎症反应的作用[15]。邻苯二甲酸二正辛酯可通过氧化应激途径引起胰岛素抵抗，进而引发Ⅱ型糖尿病[16]。苯甲酸类药能够促进胰岛细胞分泌胰岛素，并且能够降低胰高血糖素的含量，具有明显的降糖作用[17]。棕榈酸可随着其浓度的升高导致炎症因子TNF-α、IL-6表达和分泌增加，从而加剧炎症反应[18]。由此推测白及三七药对可通过多种活性成分、多种途径抑制炎症反应、降低血糖而改善DF。

从药物-疾病共有靶点及核心靶点筛选结果可知，IL-6、TP53、IL-1β、TNF、NOS3、IGF1、EDN1、CCL2等在网络中更具显著性。IL-6是最常见的炎性因子之一，主要成分为单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和纤维母细胞，与内分泌关系密切，已有研究证明其与糖尿病并发症之间关系密切[19]。TP53是重要的肿瘤抑制蛋白之一，可在细胞周期依赖性激酶诱导细胞DNA损伤环节起到抑制作用，促使细胞周期停留在G1期，最终加速细胞凋亡[20]。TNF能够作用于血管内皮细胞，损伤血管内皮或导致血管功能紊乱，造成局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死[21]。NOS3、IGF1均可作用于血管内皮，NOS3又称内皮型一氧化氮合酶，已有研究证实[22]，NOS3、IGF-1信号通路均有促进创面的血管生成，最终起到愈合创面的作用[23]。姜懿纳等[24]在论述CCL2与糖尿病关系时指出，在高浓度的血糖和三酰甘油环境下，CCL2启动子区域的CpG位点可以增加血清中CCL2的含量，从而容易诱发2型糖尿病血管并发症。由此推测白及三七药对通过抑制炎症反应、促进细胞增殖分化、抗细胞凋亡、促血管内皮生成、参与免疫调节等多靶点协同作用发挥治疗DF的作用。

富集分析结果显示，在靶点富集的前15条通路中，与白及三七药对治疗DF的相关靶标具有显著相关性的信号通路主要为AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等。AGEs与RAGE结合后会诱导氧化应激反应，异常的氧化应激反应通过激活丝裂原活化蛋白(MAP)激酶等途径激活NF-κB，NF-κB的活化可以刺激促氧化基因表达，从而导致NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子分泌增加，如此形成恶性循环，导致溃疡创面难以愈合[25]。向延卫等[26]通过实验明确指出，MAPK信号通路在治疗糖尿病溃疡创面愈合中发挥着重要作用。MAPKs能够调控多种细胞运动，并且能够参与细胞骨架蛋白的合成，故可参与伤口的愈合过程[27]。在HIF-1信号通路中，血管内皮生长因子(VEGF)是其最典型的靶基因之一。实验发现[28]，在糖尿病患者的下肢皮肤中，HIF-1和VEGF的表达是降低的，因此患者血管内皮细胞生长功能会受到损伤，此为创面易形成的因素之一。且血管主要是在低氧诱导的环境下的生成的，而HIF-1能够调节细胞对低氧的反应，因此在DF创面血管生成中起到了至关重要的作用[29]。分子对接技术在已预测出的核心成分与核心靶点的基础上进一步筛选得到匹配程度更高的4种成分与4个靶点，验证了白及三七药对的核心活性成分能够与靶基因稳定结合，为后续从白及三七药对中提取有效药物成分治疗DF提供了科学理论基础。由此推测白及三七药对修复DF是基于多条通路并与细胞因子活性、细胞因子受体结合、血红素结合等分子功能和氧化应激反应、活性氧代谢等生物过程密切相关，预测结果与已知研究相符，提示本研究所预测靶点及信号通路的可行性。

本研究通过网络药理学和分子对接技术对白及三七药对修复DF的机制进行了预测，结果表明白及三七药对治疗DF的有效成分是槲皮素、鬼伞菌素、邻苯二甲酸二正辛酯、3,4-二甲基苯甲酸等，这些成分通过调节TNF、TP53、NOS3、IL-6等蛋白，作用于AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等信号通路发挥抑制炎症反应、促进细胞增殖分化、抗细胞凋亡、促血管内皮生成、参与免疫调节等作用，从而达到治疗疾病的效果。本文初步探索了白及三七药对修复DF的机制，为体内实验提供了新的思路，但网络药理学及分子对接方法仍具有一定的局限性，因此课题组将通过实验研究对白及三七药对治疗DF的作用机制进行更进一步探究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。