连续2年氮添加对中金杨幼苗叶光合特性与碳氮分配的影响*

尚佳州 高钿惠 王卫锋 周新军 宗毓铮

(1.山西农业大学林学院 晋中 030801； 2.山西省桑干河杨树丰产林实验局科技服务中心 朔州 038300；3.山西农业大学农学院 晋中 030801)

矿质肥料施用、生物质燃烧等人类活动，导致输入到生物圈的氮快速增加(冯继广等, 2020)，目前，我国已成为继欧美之后第三大氮沉降区，且高氮沉降区正从东南向西北逐渐蔓延(Yuetal., 2019)。施氮或氮沉降会使生态系统中氮有效性提高，缓解氮匮乏温带森林生态系统生产力的氮限制(Schulte-Uebbingetal., 2018)，影响树木生长以及木材特性(Borghettietal., 2017)。但长期氮增加会导致土壤酸化并降低植物和土壤微生物多样性(Payneetal., 2017; Wangetal., 2018)。从树木个体和器官尺度，开展碳氮分配、光合作用、水分传输等方面研究，对揭示树木响应氮添加的机制有重要意义(冯继广等, 2020)。

土壤氮亏缺时，树木可将更多光合产物分配于根系以增强氮吸收能力，当氮添加提高土壤有效氮含量后，碳同化物更多分配于起支持和运输作用的主茎和侧枝，导致个体根冠比降低(李德军等, 2005a; 吴茜等, 2011; 刘洋等, 2013)。氮添加可提高土壤有效氮含量并促进个体生长，但该促进作用存在阈值效应(Högbergetal., 2006)。如氮添加量超过100 kg·hm-2a-1，水曲柳(Fraxinusmandshurica)个体生长会受到抑制(Wangetal., 2016)，且个体生长的阈值效应也存在种间差异。树木体内非结构性碳水化合物(nonstructural carbohydrate, NSC)对其生长代谢、抗寒防御甚至存活具有重要作用(Hartmannetal., 2016)，而NSC储存及其根、茎、叶器官间分配对氮添加的响应与树种有关。低氮下，长序榆(Ulmuselongata)叶中NSC积累较多；高氮下，NSC则多积累于根、茎中，这表明高氮可促进其叶片NSC向根和茎转移(洪琮浩等, 2020)。上述研究中氮添加通常在春季或夏季进行，秋季适量氮添加也可显著提高三倍体毛白杨(triploidPopulustomentosa)根系氮储存和NSC积累，促进第2年造林后个体生长，但过量氮添加则会降低其造林后成活率(王苗苗等, 2021)。氮添加下叶片NSC积累可能是氮素促进叶片含氮量、光合色素及光合酶含量增加，从而增强叶片光合作用(Nakajietal., 2002)，而氮添加对树木叶片光合作用的促进作用也存在阈值(王芳等, 2017)，过量氮添加可造成叶片营养元素比例失衡(李德军等, 2005b)，进而导致叶片光合作用受抑制(张璐等, 2020)。低剂量氮添加可明显提高红松(Pinuskoraiensis)和紫椴(Tiliaamurensis)的叶绿素含量和净光合速率，超过46 kg·hm-2a-1后的促进作用会减弱(孙金伟等, 2016)。过量氮添加下树木叶片光合作用通常会受到抑制并限制生长，进一步明确该现象的生理生态原因有助于阐明树木对氮添加的响应机制并预测全球变化下的森林生产力(冯继广等, 2020)。

杨树(Populus)在我国人工林建设中具有重要地位，也是树木生物学研究的模式树种(Galvezetal., 2011)。传统施肥和滴灌下,杨树人工林的施氮技术参数已有系统研究(席本野等，2017)，但过量施氮后发生肥效降低甚至生长受抑制现象的原因尚不清楚。‘中金杨7号’(P.×euramericana‘Zhongjin7’)是在山西金沙滩以美洲黑杨(P.deltoides)为母本、青杨(P.cathayana)为父本杂交选育的无性系良种，具有速生丰产、抗逆性强等特性，是半干旱地区新一代先锋树种(李文荣等, 2008)。本研究以‘中金杨7号’扦插幼苗为材料，探究连续2年不同强度氮添加对叶片光合特性、各器官生物量及NSC积累和分配的影响，明确过量氮添加下杨树在碳氮分配、光合作用等方面的响应机制，以期为未来氮沉降下杨树人工林精准施肥措供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

盆栽试验在山西中部晋中盆地东北部山西农业大学林业站(37°25′47″N，112°34′44″E)进行，海拔796 m，属暖温带大陆性气候，年均日照时数2 527.5 h，年均气温10.4 ℃，年均降水量397.1 mm，年均蒸发量1 649 mm，无霜期176天。

1.2 试验设计

1.2.1 扦插育苗 2019年3月底，选取‘中金杨7号’(以下简称中金杨)1年生萌条，剪成15 cm长插穗扦插于高35 cm、直径30 cm的塑料桶中，每桶1株。塑料桶置于透光遮雨棚下，以排除降雨和氮沉降对土壤的干扰。桶底平铺1层直径2～3 cm的小石子，石子上覆盖2层报纸后每桶装15 kg风干过筛土，土壤为林业站内表层砂质壤土，其基本理化性质为： pH8.29，有机质含量14.64 g·kg-1、全盐量0.097%、全氮含量1.06 g·kg-1、有效氮含量48.76 mg·kg-1、有效磷含量9.57 mg·kg-1、速效钾含量123.3 mg·kg-1、田间持水量26.94%。从插入石子中的塑料管浇水以防止土壤板结，每天傍晚称重浇水以控制土壤含水量为田间持水量的75%±5%。

1.2.2 分组处理 萌芽后缓苗1个月左右，选取长势一致的中金杨扦插苗40株，设计单因素随机区组试验，基于山西中部3 g·m-2a-1的总氮沉降强度(Yuetal., 2019)，以NH4NO3为氮源设置4个氮添加梯度： CK(0 g NH4NO3·plant-1a-1)、 N3(3 g NH4NO3·plant-1a-1)、N6(6 g NH4NO3·plant-1a-1)和N9(9 g NH4NO3·plant-1a-1)，分别相当于0、3、6、9 g·m-2a-1的氮沉降强度，每组10株重复随机分布； 所有塑料桶按株行距50 cm×120 cm放置，以便透光和浇水。NH4NO3于5月初开始每10天1次共3次添加，每次将NH4NO3按株称重后溶于水，傍晚浇水时施入桶中。2020年再次进行氮添加处理，施氮时间、施氮量和施氮方法与2019年相同。

1.2.3 指标测定 2020年8月19—21日、测定气体交换和叶绿素荧光参数，随后测定叶绿素含量和气孔特征参数等指标； 10月底收获植株，并测定生物量和碳氮含量等指标。

1.3 试验方法

1.3.1 气体交换参数 晴朗天气上午10:00—11:00，每组随机选取6～8株，每株分别在顶梢和侧枝上选取1片健康功能叶，采用便携式光合仪(Li-6400XT, Li-COR, USA)测定其净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(gs)和蒸腾速率(E)等指标。仪器参数设定为红蓝光源光强1 500 μmol·m-2s-1，叶温28 ℃，流速500 μmol·s-1。计算叶片瞬时水分利用效率(water use efficiency, WUE)=Pn/E。

1.3.3 叶绿素含量 每组随机选取5株，每株选取顶梢枝1片健康功能叶，采用乙醇提取比色法测定叶绿素a和叶绿素b含量(王学奎等, 2015)。

1.3.4 叶片厚度与气孔特性 每组随机选取5株，每株选取顶梢枝2片健康功能叶，在中间部位剪取1 cm2方块用FAA固定，石蜡切片后测量叶片厚度； 暗适应20 min左右在叶中间部位用指甲油印迹法获得气孔印迹后使用Olympus BX51显微镜拍照，每个叶片分别在10倍和40倍物镜下拍摄10张图片，测量约200个保卫细胞长度，统计气孔密度。

1.3.5 生长指标测定 采用卷尺和游标卡尺测量株高、侧枝长度和地径； 使用扫描仪(DS-50000, EPSON, JPN)扫描叶片后用ImageJ软件测量顶梢的单叶面积(leaf area, LA)，各处理均为5株重复，每株选取3片功能叶，105 ℃杀青1 h后于75 ℃烘至恒质量，称量其干质量，分别计算单叶净光合速率(net photosynthesis per leaf)和比叶质量(leaf mass per area, LMA)。2020年10月底落叶后收获植株时，先将根冲洗干净，整株分为根、主茎和侧枝3部分，分别105 ℃杀青1 h后于75 ℃烘至恒质量，称重并计算整株总干质量、根冠比以及器官干物质分配比例。将各器官干样粉碎过200目筛，采用苯酚-硫酸法测定可溶性糖和淀粉含量(Landhäusseretal., 2018)，重铬酸钾氧化法测定全碳含量，凯氏定氮法测定全氮含量(王学奎等, 2015)，计算单位叶面积氮含量(leaf nitrogen per unit area,Narea)=叶氮含量×LMA，光合氮利用效率(photosynthetic nitrogen use efficiency, PNUE)=Pn max/Narea。

1.4 数据处理

使用Excel2013软件进行数据整理。利用SPSS 18.0软件(IBM, Chicago, USA)先对数据进行初步检验，保证数据的正态性和方差齐性，后用单因素ANOVA进行方差分析，LSD检验进行多重比较(P<0.05)。采用Sigmaplot 12.5软件(Systat Software, SanJose, USA)作图。

2 结果与分析

2.1 中金杨幼苗叶光合特性对氮添加的响应

连续2年氮添加后，中金杨幼苗顶梢叶单位叶面积的Pn降低，N9处理的Pn显著低于CK(F=4.14;P=0.037)； 侧枝叶单位叶面积的Pn表现出明显促进，N6处理下Pn最大，N9处理的Pn显著低于N6(F=10.23;P=0.026)，且与N3处理无显著差异。顶梢和侧枝的gs和Ci随氮添加量增加均呈下降趋势，而WUE显著增大，表明氮添加下叶肉细胞利用CO2的能力增强、气孔关闭并导致叶片用水效率提高(图1)。

图1 连续2年氮添加对中金杨幼苗顶梢和侧枝叶气体交换参数的影响(n=5)Fig. 1 Leaf gas exchanges of top and lateral branches in hybrid poplar (P. × euramericana ‘Zhongjin7’) seedlings after 2 years’ nitrogen addition数值为平均值±标准误，不同小写字母代表处理间存在显著差异(LSD检验，P<0.05)，下同。Values are mean ± SE. Different lowercase letter means significant difference among treatments (LSD test; P<0.05). The same below.

随着氮添加量增加，基于鲜质量的叶绿素a含量(F=15.44;P=0.001)和叶绿素b含量(F=18.59;P=0.001)均显著增加。N6和N9处理的叶绿素a含量较CK分别增加42.3%和53.6%，N3、N6和N9处理的叶绿素b含量较CK分别增加20.2%、46.2%和56.4%，且N6和N9显著高于N3处理(表1)，这表明中金杨幼苗叶片叶绿素含量并未随氮添加量增加而呈现下降趋势。

表1 连续2年氮添加对中金杨幼苗叶片叶绿素含量的影响(n=5)Tab.1 Leaf chlorophyll content changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

3个氮添加处理中金杨顶梢枝功能叶的Fv/Fm与对照无显著差异； N3和N6处理的ФPSⅡ(F=7.44;P=0.005)和ETR(F=7.64;P=0.005)均显著低于CK，而N9处理与CK无显著差异； NPQ的变化趋势与之相反； 4个处理的qP无显著变化。以上结果表明，N3和N6处理下光反应阶段实际量子产量低于CK，且由于N3和N6处理的NPQ增加，导致供给暗反应的还原力下降； 而N9处理下光反应供给的还原力与CK相同(表2)。

表2 连续2年氮添加对中金杨幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响(n=5)Tab.2 Chlorophyll fluorescence parameter changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

连续2年氮添加后，中金杨顶梢功能叶N3和N6处理的单叶面积和单叶干质量显著高于CK，而N9处理与CK相同； N9处理的LMA较CK显著降低(图1A)； 叶氮含量(F=15.92;P<0.001)和单位叶面积氮含量(F=6.84;P=0.004)均随氮添加量增加显著增大； 由于其Pn呈下降趋势，导致PNUE持续显著降低。N6和N9处理的上、下表皮气孔密度均显著高于CK，气孔长度则显著低于CK，表明高氮添加下中金杨叶片变薄且气孔变小变密(表3)。

表3 连续2年氮添加对中金杨幼苗顶梢叶经济性状与气孔特性的影响(n=15)Tab.3 Leaf economic and stomatal traits changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

2.2 中金杨幼苗生长与器官干物质积累对氮添加的响应

氮添加第1年，中金杨幼苗株高和地径显著增加； 第2年株高增量仅N3和N6处理显著高于CK，N9处理与CK无差异，4个处理地径增量无显著差异。氮添加后侧枝数和侧枝总叶片数也显著增加，表明氮添加对侧枝和侧枝叶片生长具有促进作用，而氮添加未增加顶梢叶片数。氮添加2年后，根干质量(F=3.90;P=0.040)、主茎干质量(F=77.35;P<0.001)和侧枝干质量(F=5.22;P=0.020)均显著高于CK，但N9处理的主茎干质量显著低于N3和N6处理。连续2年氮添加后植株根茎总干质量随施氮量增加呈先升后降趋势，N9处理仍显著高于CK(表4)。

表4 连续2年氮添加对中金杨幼苗生长与器官干物质积累的影响(n=5)Tab.4 Growth and organ dry matter accumulation in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加2年后，中金杨幼树典型植株主茎和侧枝的拓扑图如图2所示，随氮添加量增加，持续促进侧枝萌芽和伸长生长，而顶梢生长则表现阈值效应。

图2 连续2年氮添加中金杨幼树典型植株主茎与侧枝的拓扑图Fig. 2 Topological diagrams of typical poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加后根生物量分配比例显著低于CK(F=5.24;P=0.020)，符合最优生长理论，主茎生物量分配比例则显著高于CK(F=4.60;P=0.029)； 但随着氮添加量增加，N3、N6和N9处理间根和茎干物质分配比例并无显著差异； 氮添加后侧枝生物量分配比例均值略有增大但与CK无显著差异(图3)。

图3 连续2年氮添加对中金杨根茎枝生物量分配比例的影响Fig. 3 Biomass distribution percentage changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加2年后，叶可溶性糖含量(F=9.34;P=0.005)显著高于CK； N9处理的叶片淀粉含量显著低于N6处理(F=10.03;P=0.001)； 随着氮添加量增加，主茎木材的淀粉含量(F=9.50;P=0.003)显著降低； 树皮可溶性糖积累而根可溶性糖含量略有降低，可能与根氮同化和生长增强消耗较多同化物有关(图4)。

图4 连续2年氮添加对中金杨幼苗各器官NSC含量的影响(n=3)Fig. 4 Organ NSC content changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

随着氮添加量增加，中金杨叶(F=45.50;P<0.001)和根(F=12.23;P=0.002)全氮含量显著增加； N3和N6处理的主茎木材和树皮、N3处理的侧枝全氮含量显著低于CK，N6和N9处理的侧枝含氮量显著高于CK(图5A)。N9处理的碳氮比在侧枝(F=15.84;P<0.001)和根(F=10.96;P=0.001)显著低于CK(图5B)。 结合前述光合作用和生物量结果分析可知，即使有超出体内生理代谢的氮需求量，高氮处理下中金杨叶和根等部位仍在吸收并同化氮素。

图5 连续2年氮添加对中金杨幼苗各部位碳氮比的影响(n=4)Fig. 5 C/N changes of different positions in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

3 讨论

3.1 顶梢和侧枝叶光合特性对氮添加的响应机制

低剂量氮添加可提高叶片光合酶含量和光合速率，促进植株生物量积累。本研究连续2年氮添加后，中金杨幼苗顶梢和侧枝功能叶虽然均表现出气孔关闭和WUE升高，但其净光合速率对氮添加表现出不同响应趋势。中低剂量氮添加下顶梢叶叶面积增大、叶绿素和氮含量增加、气孔变小变密，在促进根茎叶生物量积累的同时，使叶中淀粉和可溶性糖积累显著提高，反馈抑制了光系统量子产量、电子传递以及净光合速率，表现出明显的库限制。随施氮量增加，黄麻(Corchoruscapsularis)叶片光呼吸速率持续增大，且光呼吸可为叶内硝酸还原过程提供还原力(陈锦强等, 1983)。本研究中，相比于中低剂量氮添加处理，高剂量氮添加处理叶片淀粉含量降低、光量子产量和电子传递速率升高叶片氮含量增加，表明高氮下中金杨叶肉细胞内硝酸同化过程可能消耗了大量的光反应还原力以及暗反应的碳同化物(Bloom, 1997; 2015)，竞争用于光合作用的还原力，进而造成叶内淀粉含量减少，光合速率呈下降趋势。这一过程也可能是高剂量氮添加处理下侧枝叶净光合速率下降的原因； 而中低剂量氮添加处理下，侧枝生长量明显高于CK，且可溶性糖和淀粉积累并无明显增加，表明此时未发生库限制，因此侧枝叶片净光合速率显著增大。

3.2 过量氮添加对中金杨同化物分配的调控机制

氮添加第1年，中金杨幼苗株高和地径显著增大，高剂量氮添加处理未表现出生长抑制。氮添加2年后，中低剂量氮添加处理的单叶、茎和根生物量积累均显著增加，而根的生物量比例降低，这符合最优分配理论，但也可能是由于土壤NH4+浓度增大抑制根尖伸长和根系生长(Brittoetal., 2002)。高剂量氮添加处理的侧枝生长量仍然最高，单叶干质量、顶梢长和主茎分别比中低剂量氮添加处理降低25.8%、13.7%和13.1%，而根干质量无显著下降，即从形态学上端向下端降低比例逐渐变小； 单叶面积和净光合速率均显著低于中低剂量氮添加处理，表明此时中金杨顶梢、主茎和根系生长处于源限制。长期高剂量氮添加下，美洲黑杨人工林土壤外生菌根真菌物种丰富度和侵染率均显著下降(Yangetal., 2021)，这可能是由于宿主树木根系向真菌的碳投资减少所致，与本文高剂量氮添加下中金杨生长处于源限制的结果一致。低量滴灌施氮可显著增加美洲黑杨(Leeetal., 2005)和毛白杨(席本野等, 2017)地上部生物量和林分生产力，而高施氮量则不明显，本研究的盆栽试验结果可从生理生态角度解释该现象。另外，过量氮添加下小叶杨(P.simonii)叶和根中生长素含量降低而脱落酸含量升高(Luoetal., 2015)，过量NO3-可竞争性抑制硝酸转运蛋白NRT1.1对生长素的运输(Krouketal., 2010)。因此，顶梢生长素合成和运输降低可能是本研究中高氮抑制顶梢生长、促进侧枝生长以及叶气孔密度增加的原因之一。今后可进一步研究过量氮添加下的茎尖生长素合成、叶片硝酸盐同化、碳同化物装载与卸载及其关系，以深入揭示氮添加下中金杨的碳氮关系响应机制。

4 结论

连续2年中低剂量氮添加显著促进中金杨幼苗根茎叶器官生长，而根冠比降低，由于库限制使得叶中非结构性碳积累显著增加并负反馈限制顶梢叶片光合作用； 由于侧枝生长受到显著促进，使得中、低剂量氮添加下侧枝叶片光合作用显著提高。高剂量氮添加处理下，叶片光合作用显著低于中氮处理，可能由于叶片氮同化过程增强而竞争光合作用的还原力。生长素合成和运输降低可能是高剂量氮添加处理下中金杨顶端优势弱化及碳氮分配变化的重要原因。