有氧运动对糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达的影响

张明耀

前言

糖尿病是一种由于遗传或后天因素共同体作用下，导致机体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗，而发生糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱的慢性综合征。根据2021年国际糖尿病联合会(IDF)发布的最新糖尿病调查数据显示，全球20至79岁的成年人中，糖尿病患者数量约为5.37亿人(患病率10.5%)。按目前的发展速度推算，到2030年全球成年人糖尿病患者人数将增至6.43亿，2045年将上升到7.83亿。目前，我国糖尿病患者数量仍居于世界首位，约为1.41亿人，预计到2030年将达到1.64亿人。糖尿病已成为21世纪主要公共卫生问题，给个人、家庭及社会带来沉重的经济、生活负担。目前，防治糖尿病的方法主要包括药物治疗、饮食疗法、运动干预、糖尿病教育和自我血糖监测等五个方面。在临床上糖尿病治疗仍是以药物为主，然而药物治疗容易带来一些副作用。近年来，运动已成为糖尿病预防和治疗的有效手段，但有关运动防治糖尿病的具体机制尚未完全明确，还有待进一步探索。因此，本研究通过高脂饲料喂养，注射小剂量链脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠，并对糖尿病大鼠进行8周游泳运动干预，观察游泳运动对糖尿病大鼠血糖、血脂代谢和骨骼肌AMPK、GLUT4蛋白表达的影响，旨在为运动防治糖尿病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选用6周龄的SPF级雄性SD大鼠40只，体重130±20g，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号：SCKX(粤)2013-0002。适应性喂养1周后，大鼠随机分为正常对照组(NC，n=10)和模型组(n=30)，NC组大鼠普通饲料喂养，模型组大鼠采用高脂饲料喂养8周后，禁食12h，行腹腔注射小剂量的链尿佐菌素(STZ，30mg/kg)，最终形成糖尿病模型大鼠有25只(成模率83%)。再将糖尿病大鼠随机分为糖尿病安静组(DM，n=12)和糖尿病运动组(DME，n=13)。所有大鼠分笼饲养，自由饮水摄食，每日添加足够的饲料，定期更换垫料，室内温度为24±2℃，相对湿度40%～60%，自然光照。

1.2 运动方案

糖尿病运动组(DME)大鼠进行无负重游泳运动干预8周，先进行适应性游泳运动1周，前两天每天运动20min，之后每天逐步增加10～20min。从第二周开始每天运动60min，1次/天，6次/周。运动时间统一为每天晚上18:00～21:00，水温30±2℃，水深﹥65cm，保证平均每只老鼠拥有足够的活动面积(≥200cm2)。

1.3 取材与指标检测

最后一次游泳运动结束后，所有大鼠禁食，空腹12h，行腹腔注射水合氯醛(0.3ml/100g)，待大鼠麻醉后置于冰块上，迅速采集血液、股四头肌等组织。腹主动脉取血于抗凝管内静置1h后，4℃、3000转/min，离心10min，取血清分装于EP管，-20℃冰箱保存待测血液指标(FBG、FINS、血脂四项等)。大鼠股四头肌用4℃生理盐水清洗血渍，吸干，分成数段后锡箔纸包裹放液氮灌中速冻，之后转存至-80℃超低温冰箱，用于检测骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达。空腹胰岛素(FINS)和血脂四项(TG、TC、LDL-C、HDL-C)的检测采用联酶免疫吸附测定法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书进行；AMPK和GLUT4蛋白表达采用Western Blot法。以上各实验步骤严格按照实验标准要求进行。

1.4 数理统计

运用SPSS21.0统计软件对本研究中所得的实验数据进行统计学处理，数据以均值±标准差(M±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析和独立样本t检验，P<0.05为显著性水平，P<0.01为非常显著性水平。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI 的变化

如表1所示，与NC组相比，DM组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著升高(P<0.05)，而ISI显著降低(P<0.05)。与DM组相比，DME组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著降低(P<0.05)，ISI显著升高(P<0.01)。

表1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和ISI的变化(M±SD,单位：mmol/L)

2.2 各组大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的变化

如表2所示，与NC组比，DM组大鼠TC、TG和LDL-C含量均显著增加(P<0.01)，而HDL-C含量显著减少(P<0.01)；与DM组相比，DME组大鼠TC、TG、LDL-C含量均显著降低(P<0.01)，而HDL-C含量显著增加(P<0.05)。

表2 各组大鼠TG、TC、HDL-C和LDL-C的变化(M±SD单位：mmol/L)

2.3 各组大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达量的变化

如表3所示，与NC组比，DM组大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)；与DM组相比，DME组大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。

表3 各组大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达量的变化(M±SD)

3 讨论

3.1 有氧运动对糖尿病大鼠血糖及胰岛素抵抗的影响

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其发病机制比较复杂，目前认为，胰岛素分泌不足和/或胰岛素抵抗均有可能引起糖尿病。糖尿病患者以高血糖为主要特点，典型的临床症状是“三多一少”症，即多饮、多尿、多食和体重减少。正常生理情况下，机体糖代谢的调节是由胰岛素和胰高血糖素共同完成。进食后，胰岛素分泌增多，有利于细胞组织对葡萄糖的摄取利用，促进糖合成，减少糖异生；饥饿时，胰高血糖素分泌增多，糖分解和糖异生加强。胰岛素和胰高血糖素的协调控制维持着机体糖代谢的平衡。研究表明，长期高脂饮食结合链脲佐菌素能使大鼠形成糖尿病[1]。本研究结果显示(见表1)，与NC组相比，DM和DME组，FBG、FINS和HOMA-IR均显著升高(P<0.05)，ISI显著降低(P<0.05),提示8周高脂饮食和注射小剂量链脲佐菌素使大鼠血糖明显升高，并且出现胰岛素抵抗状态，说明成功诱导出糖尿病大鼠模型，符合糖尿病动物模型制备要求，为后续运动干预提供了基础。

运动作为多种慢性疾病干预手段，发挥着越来越重要的作用。研究表明，不管是有氧运动还是抗阻运动，都能有效改善血糖调节和胰岛素抵抗[2、3]。合理的运动锻炼可以减轻体重，降低人和大鼠FBG、FINS，增加胰岛素敏感性和糖耐量，改善胰岛素抵抗症状[4]。Motahari等[5]发现运动不仅可以降低糖尿病患者血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗，还能增强胰岛素敏感性，减轻高胰岛素血症。Snowling和Hopkins对糖尿病患者进行有氧、抗阻和联合训练干预研究发现，三种运动模式都可以改善患者HbA1c、空腹和餐后血糖水平、胰岛素敏感性和空腹胰岛素水平，并且不同运动模式之间干预效果差异较小[6]。Jelleyman等[7]研究表明，高强度间歇训练可以增加骨骼肌氧化能力、血糖控制和胰岛素敏感性。本研究结果显示(见表1)，与DM组相比，DME组，FBG、FINS和HOMA-IR均显著降低(P<0.05)，ISI显著升高(P<0.05)；说明游泳运动能使糖尿病大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR显著下降，ISI显著升高，大鼠高血糖、高胰岛素和胰岛素抵抗状态得到缓解，游泳运动能够改善糖尿病大鼠血糖代谢状况及胰岛素敏感性。运动可以增加骨骼肌线粒体含量和氧化酶，通过胰岛素依赖和胰岛素非依赖机制增强骨骼肌葡萄糖摄取，改善血糖调节，增加的胰岛素敏感性[8、9]。

3.2 有氧运动对糖尿病大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的影响

脂代谢在糖尿病的发生、发展过程中扮演着重要的角色，脂代谢紊乱会引起超重、肥胖、胰岛素抵抗等，导致糖尿病及其并发症的发生。研究表明，有氧运动有利于维持脂代谢平衡，改善糖尿病及其并发症[10]。血浆中FFA、TG、LDL含量增加，是导致IR的重要原因之一[11]，FFA和TG升高会抑制胰岛素介导的葡萄糖的摄取、氧化和利用。本研究结果显示(见表2)，糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C含量均明显高于NC组(P<0.05)，而HDL-C含量明显低于NC组(P<0.01)。提示长期的高脂饮食摄入过多的能量，使体内FFA和TG、TC、LDL-C含量升高，导致大鼠脂代谢异常。以往研究表明，运动可以改善机体的糖脂代谢，降低血清TG、TC、LDL含量，提高HDL，减轻肥胖造成高血脂现象[12]。8周以上的游泳运动不但具有减肥、降低血脂、改善胰岛素敏感性的作用，而且还可以使2型糖尿病大鼠机体的高血糖水平明显减低[13]。本研究结果显示(见表2)，与DM组比较，DME组大鼠HDL-C显著升高(P<0.05)，FFA、TG、TC和LDL-C水平均显著均降低(P<0.01)，提示运动能降低大鼠血清TG、TC和LDL-C水平，增加HDL-C含量。结合本研究糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI，发现运动能增加大鼠胰岛素敏感性，降低空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数，运动改善高脂饮食大鼠糖尿病症状的机制可能与纠正脂代谢紊乱有关。运动使骨骼肌对脂肪酸氧化能力增强，减少脂质异位沉积，改变血清脂蛋白的成分比例，降低血脂FFA和TG浓度，进而改善脂代谢紊乱。

3.3 有氧运动对糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达水平的影响

AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)在调节生物能量代谢中起到关键作用，是主要的非胰岛素依赖型葡萄糖摄取调节剂，通过运动激活骨骼肌中的AMPK可诱导葡萄糖转运、脂质和蛋白质合成以及营养代谢[14]。AMPK在运动后保持短暂激活，并调节涉及线粒体生物功能以及氧化能力的几个下游靶标，有氧运动增加骨骼肌线粒体含量和氧化酶，从而改善葡萄糖和脂肪酸氧化，并增加参与胰岛素信号传导的AMPK蛋白表达[15、16]。Stephens等[17]研究发现，在培养骨骼肌细胞时，应用AMPK作为特异性激活剂，能够增加胰岛素刺激后葡萄糖转运的能力。另外，骨骼肌对葡萄糖的利用效率影响到机体血糖调节，胰岛素介导下葡萄糖的摄取与转运机制比较复杂，GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)对维持骨骼肌细胞葡萄糖稳态起到重要作用[18、19]。研究显示，降低脂肪组织GLUT4表达，胰岛素刺激的骨骼肌对脂肪摄取能力会下降，胰岛素抵抗与肥胖大鼠骨骼肌GLUT4下降有关[20、21]。运动可以诱导骨骼肌细胞内GLUT4易位，促进骨骼肌对葡萄糖的摄取，耐力训练、高强度间歇训练和力量训练均可引起糖尿病患者骨骼肌GLUT4蛋白含量增加[22-24]。本研究结果显示(见表3)，与DM组相比，DME组大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表达均显著升高(P<0.01)，提示DME组大鼠血糖、胰岛素敏感性及血脂(TG、TC、LDL-C)改善可能与AMPK和GLUT4蛋白表达增加有关。有氧运动能够激活AMPK、增加骨骼肌细胞GLUT4转位，通过AMPK信号通路或PI3K/AKT/GLUT4信号转导通路，促进葡萄糖的摄取、利用和脂肪酸的氧化，减少糖原合成与脂质的堆积，特别是骨骼肌和肝脏脂肪的异位堆积，AMPK还可能通过非胰岛素依赖途径调节糖脂代谢，改善大鼠胰岛素抵抗[25-27]。

4 结论

8周游泳运动能够较好地控制糖尿病大鼠血糖、血脂水平，提高大鼠胰岛素敏感性；游泳运动能够增加大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4的蛋白表达，改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。