多酚交联的壳聚糖水凝胶的制备及其性质研究

＊胡亚云 张英萍 陈琳

（西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西 712100）

水凝胶是由水溶性高分子经过交联后形成的三维网络结构，能够吸收并保持大量的水，其具有良好的生物相容性和亲水性[1]，类似生物体软组织，在生物医学领域有着广泛的应用[2]。壳聚糖基水凝胶具有良好的细胞相容性、可降解性和低毒性，在食品生物医药领域被广泛研究[3]。以单一的壳聚糖为原料制成的水凝胶存在机械性能及保水性差等不足使其应用受限。将多酚物质和壳聚糖混合后制备的多酚/壳聚糖水凝胶综合了多酚生物活性及壳聚糖的优良特性，具有良好的应用价值。

1.材料与方法

(1)材料与仪器

壳聚糖（CS），脱乙酰度＞95%，黏度100～200mPa·s上海麦克林生化科技有限公司；没食子酸（GA）和MTT，Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；30%过氧化氢（30% H2O2），深圳华大基因科技有限公司。

M4 Victor X3多功能酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司；TA-XT Plus质构仪，英国萨里稳定微系统有限公司；BSC-1500IIA2-X生物安全柜，济南鑫贝西生物技术有限公司。

(2)实验方法

①氧化没食子酸的制备。将没食子酸和过氧化氢混合，然后将该溶液体系放入90℃的水浴锅中加热2h，取出后在室温冷却30min。随后将GA溶液冷冻干燥，以完全除去H2O2。

②水凝胶的制备。将壳聚糖溶液与不同质量浓度的没食子酸混合，分装到12孔板，在-18℃冰箱中放置12h后取出，室温解冻2h得到水凝胶。

③水凝胶的表征。A.傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）。参考Thanyacharoen[4]的方法，用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）对样品官能团信息进行测定。

B.流变测试。参考Guaresti[5]的方法，用美国Waters TA流变仪（DHR-1）进行测定。

C.质构测试。参考Qi[6]的方法，使用英国STABLEMICVO公司TA.XT PLUS/50进行循环压缩测试。

D.差示扫描量热仪（DSC）。参考Kandile[7]的方法进行测定。

E.溶胀率。水凝胶溶胀率的测定首先将在室温下在去离子水中平衡的冰凝胶称重（WE），然后将其冻干并再次称重（WO）。溶胀率SR（%）通过公式(1)计算：

式中：SR表示溶胀率，%；WE表示冰凝胶在室温下在去离子水中平衡重量，g；Wo表示冰凝胶冻干后的重量，g。

④体外细胞毒性测定。根据先前的方法[8]对水凝胶体外细胞毒性进行测定。细胞活性按照公式（2）计算：

式中：Ap表示处理组在490nm处的吸光度值；Ac表示对照组在490nm处的吸光度值。

(3)数据处理

单项实验最少重复3次，结果表示为均值±标准差。采用SPSS V18.0软件对数据进行单因素方差分析和相关性分析，如果方差分析差异性显著（p＜0.05），则使用Duncan进行多重比较。

2.结果与分析

(1)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析

图1显示，与CS的峰相比，6种样品在1631cm-1附近显示出明显的峰，对应于CS和GA之间的C=N键的伸缩振动吸收峰，表明CS与GA之间形成了席夫碱键[9]。而没食子酸或壳聚糖单独存在时，不能检测到酯键和C=N键。这些结果表明水凝胶中没食子酸与壳聚糖的缀合[10]。887cm-1的吸收峰为糖环伸缩振动吸收峰，说明CS和OGA反应并没改变CS的骨架。

图1 CS、GA和不同浓度CS-GA水凝胶的FTIR光谱

(2)流变学测试

由图2可知壳聚糖水凝胶的储能模量值均随着OGA浓度的增加呈上升趋势。这是因为随着壳聚糖和没食子酸浓度的增加，二者所提供的交联位点增加，使得交联后分子链缠绕聚集更加紧密。同时在ω=0.01～100rad/s范围内，储能模量＞损耗模量，即G′＞G″，这说明6种水凝胶表现为粘弹性固体。

图2 不同浓度CS-GA水凝胶的储能模量(a)和损耗模量(b)随角频率(0.1～100rad/s)的变化曲线图

(3)质构测试

图3所示，随着GA浓度的增加，显著提高了水凝胶的硬度，形成更坚固耐用的水凝胶。另外，2% CS比1.5% CS制备的水凝胶硬度显著提高，这是由于高浓度壳聚糖可以形成更致密的结构。其次，2%的壳聚糖由于其结构更加致密，含水量减小。

图3 不同浓度CS-GA水凝胶的硬度图柱上标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

(4)溶胀性

图4可知，6种水凝胶的溶胀率均在60%以上，最高溶胀率可达到332.89±20.5%，说明6种水凝胶均具有良好的溶胀性能。水凝胶样品的溶胀率均随着GA浓度的升高而降低，这主要是因为水凝胶网络的内部结构交联缠结加剧导致水凝胶内部更高的交联强度，削弱了水分子正常渗透。2% CS水凝胶溶胀率显著小于1.5% CS，这是更高的浓度提供更多的交联位点，使分子间存在更高的交联密度，形成了更加紧密的凝胶网络结构。

图4 不同浓度CS-GA水凝胶的溶胀率图柱上标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

(5)热稳定性

图5为6种水凝胶在20～250℃的升温程序内的热流变化。CS1.5%-GA1%、CS1.5%-GA2%、CS1.5%-GA3%、CS2%-GA1%、CS2%-GA2%、CS2%-GA3%水凝胶的最大降解温度分别为113℃、113℃、116℃、114℃、113℃、116℃。100℃附近的降解变化可能归因于壳聚糖解聚产物的降解。6种凝胶的热降解温度结果相差不大，但总体而言，更高的GA浓度即更高的交联程度，可能使CS结晶度提高使其热稳定性提高。

图5 不同浓度CS-GA水凝胶的DSC曲线

(6)体外细胞毒性

MTT实验结果证实，6种CS-GA水凝胶的细胞存活率均在100%以上。结果说明水凝胶对C2C12细胞生长无明显抑制作用，而且能够促进C2C12细胞的增殖，具有良好的细胞相容性。另外随着GA浓度的增加，细胞存活率显著降低，原因可能是随着水凝胶内部交联程度的进一步增加，内部供细胞生长、增殖的孔隙进一步减小，从而导致细胞存活率降低。

图6 不同浓度CS-GA水凝胶的细胞存活率图柱上标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

3.结论

研究结果表明，使用CS和GA通过冷冻-解冻的方法来制备水凝胶是切实可行的。CS与OGA通过席夫碱反应进行交联，冷冻解冻进一步形成交联网络。GA的加入不仅水凝胶的机械强度得到了改善，还具有良好的热稳定性，较好的溶胀性能。体外细胞毒性结果表明，CS-GA水凝胶能促进C2C12细胞的增殖，具有良好的细胞相容性。以上结果表明，含有CS-GA水凝胶在生物医学领域中有很大的应用前景，尤其适用于作为伤口敷料。