基于网络药理学及分子对接技术研究人参-陈皮配伍治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制＊

刘 祎，董浩然，田燕歌，刘学芳，3，赵 迪，冯素香，3＊＊

（1.河南中医药大学中医药科学院 郑州 450046；2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心 郑州 450046；3.郑州市中药质量控制与评价重点实验室 郑州 450046）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）属于呼吸系统常见病与多发病，是一种常见的以持续性呼吸系统症状和气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限是由于长期暴露在有毒颗粒或气体下的气道和（或）肺泡异常而引起[1]。因其高患病率和相关后遗症带来的残疾率和死亡率，已成为全球公共卫生的重大挑战，具有极高的流行病学和社会经济学影响。秦国双等[2]调查发现，在1990年至2017年间，我国COPD疾病患病率、发病率、伤残损失寿命年率均呈现上升趋势。慢性阻塞性肺病已经成为与高血压、糖尿病“等量齐观”的慢性疾病，构成我国重大疾病负担。COPD涉及肺、脾、肾等多个脏腑，病理机制涉及炎症反应、氧化损伤、蛋白酶/抗蛋白酶失调、免疫障碍、损伤/修复等多个方面[3]。COPD属于现代医学理论体系的概念，中医认为COPD是多种慢性肺系疾病反复发作、迁延难愈，临床主要表现为活动后呼吸困难、咳嗽、咳痰，现代中医临床将COPD归为“喘证”“肺胀”“咳嗽”的范畴中。诸多医家认为本病病变首先在肺，继而影响脾、肾，后期病及心、脑。“正虚积损”是COPD的主要病机，治疗以调补为法而兼以祛邪扶正、止咳化痰、标本同治[4-5]。现代医学研究表明COPD患者的肺、气道、肺泡壁和肺部血管均有炎症反应，患者体内的炎症细胞如淋巴细胞、中性粒细胞等被激活后可以释放多种细胞因子与炎症介质，包括白细胞介素-8（IL-8）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等[6]。

人参常作为补虚药、陈皮作为理气药出现。人参味甘温、微苦，归肺和脾经；具有补脾补气，生津益肺之功，可用于治疗肺虚咳喘等[7]。陈皮味辛、温，有苦味，归脾和肺经；具有祛湿化痰、理气以及健脾之功，可用于治疗痰多咳嗽[8]。陈皮祛湿化痰，理气健脾，擅行气；人参益气健脾，擅补气；二者配伍，补而不滞，行而不耗。中医临床常用治疗COPD的复方有补肺健脾方、补中益气汤、参苓白术散、益气扶正汤、补脾益肺丸等[9-11]。王平[12]自拟补脾益肺丸（人参，白术，陈皮等）治疗COPD86例，且效果明显优于西药对照组；张玲[13]采用益气扶正汤（人参、刺五加、黄芪、丹参等）配合针刺治疗COPD288例，林琳[14]用健脾益肺冲剂（人参、白术、茯苓等）治疗COPD患者，发现其能够缓解呼吸肌肌力及肺功能进行性下降，并有减轻患者慢性缺氧和二氧化碳潴留的作用，同时改善患者的咳、痰、喘症状。刘海燕[15]等用化痰止咳汤（党参、半夏、陈皮等）治疗COPD，达到了调节体液免疫、提高血清sIgA水平的效果，使患者发病次数减少，病情发作程度减轻。在治疗COPD的常用药中，基于此，本研究选用人参-陈皮配伍探讨其治疗COPD的作用机制。

网络药理学是系统生物学、药物化学、药理学等多学科整合的一门新兴学科，能够反映“药物-基因-靶点-疾病”之间的复杂作用网络，被广泛应用于药对、方剂配伍规律解释等方面，而分子对接技术可通过计算机模拟计算得到小分子以及受体蛋白的亲和力，进一步实现药物的筛选与设计[16-17]。

本研究采用网络药理学、分子对接技术和体外抗炎活性验证，分析人参、陈皮中活性成分的潜在作用靶点与通路，进而探讨人参-陈皮配伍对COPD的潜在治疗作用，研究思路如图1所示。

图1 人参-陈皮配伍治疗COPD的网络药理学流程图

1 方法

1.1 人参、陈皮药物活性成分及其潜在作用靶点的筛选

运用TCMSP数据库（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索人参、陈皮的药物主要活性成分和基因靶点。以口服生物利用度OB值≥30%、类药性DL≥0.18为人参、陈皮活性成分的筛选标准，获得人参、陈皮活性成分及作用靶点，剔除没有相关靶点的化学成分，并将靶点信息经Uniport数据库标准化。

1.2 人参、陈皮与COPD共有靶点的收集

以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”为关键词，分别在DrugBank、TTD、GeneCards数据库检索COPD相关靶点，筛选并删除重复靶点。将筛选得到的人参、陈皮药物活性成分靶点和COPD相关靶点导入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网站，得到药物和疾病共有的靶点并进行整理。

1.3 蛋白互作（PPI）网络的构建和核心靶点的筛选

将“1.2”所得的药物和疾病共有靶点导入Cytoscape3.6.1软件析平台，选择种属为“Homo sapiens（人类）”，其他条件保持默认设置，BisoGenet插件构建蛋白相互作用（PPI）网络图，使用Cytoscape中的CytoCNA插件、“Analysis Network”工具得到蛋白相互作用网络之间的相关参数。基于“度（DC）”“间性中心性（BC）”“亲和中心性“（CC）”几个参数，对PPI网络进行拓扑分析。

1.4 相关作用靶点的生物学注释分析

将“1.2”收集得到的人参-陈皮和COPD的共有靶点导入DAVID数据库（https://DAVID.ncifcrf.gov）中，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。选择物种名称为“Homo sapiens”，通过点击“Custom Analysis”选项进入，在“Enrichment”中分别选择生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）和KEGG通路富集分析。以P＜0.01为筛选标准，获得人参-陈皮配伍治疗COPD的信号通路。

1.5 分子对接

采用分子对接验证“人参-陈皮”治疗COPD的潜在活性成分与潜在靶点之间的相互作用关系。通过chem spider（www.chemspider.com）下载关键化合物（川陈皮素、山奈酚、橙皮素、人参皂苷rh2）的2D结构，基于PDB数据库（http://www.rcsb.org）下载关键蛋白（AKT1、TNF、PTGS2）3D结构。采用PyMOL软件对蛋白质进行去水，提取配体等处理，Auto Dock 1.5.6软件将关键蛋白及化合物pdb格式转为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后通过Autodockvina进行将小分子化合物与核心靶点进行分子对接，并计算对接结果的结合能；最后用PyMOL、Discovery Studio4.5将结果可视化处理并保存。

1.6 体外抗炎活性评价

COPD是一种慢性气道炎症性疾病，蛋白酶的过量活化、白介素水平的升高、上皮细胞化生为杯状细胞、TNF-α的升高等都有可能诱导炎症基因高表达，TNF-α的升高是COPD严重程度的重要标志[18-19]。实验研究发现，人肺泡上皮细胞（A549细胞）是一种气道上皮细胞系，A549细胞在TNF-α刺激后，促炎细胞因子IL-6和IL-8的表达显著升高，模型稳定，常作为体外细胞炎症模型[20]。

采用TNF-α（10 ng·mL-1）诱导A549细胞（购于中国科学院上海生命科学院研究院细胞资源中心）建立体外炎症模型，评价人参、陈皮中的活性成分对TIMP-1、IL-8、MMP-9等炎症介质分泌量的影响。将A549细胞均匀接种于6孔板中，每板按1×106个并培养24 h。实验设空白组、模型组、实验组，每组6个复孔，在37℃，5%CO2条件下培养24 h后，将细胞上清液收集后，离心，分装，于-80℃温度下保存备用。按ELISA试剂盒说明书，将山奈酚（批号：110861-201310），川陈皮素（批号：20120723）、橙皮素（批号110721-201316）、人 参 皂 苷rh2（批 号：111748-200501）作用于A549细胞后，检测细胞培养上清中TIMP-1（博士德生物有限公司，批号：2349123109）、IL-8（博士德生物有限公司，批号：13411851103）、MMP-9（博士德生物有限公司，批号：18411951103）等分泌量。

2 结果

2.1 人参、陈皮中活性成分与“药物-化合物-靶点”网络的建立

在TCMSP数据库中筛选出人参活性成分17个，陈皮5个，共得到22个活性成分，结果见表1。将以上22个活性成分用Cytoscape3.6.1软件制作活性成分和对应靶点关系网络图，结果见图2。此网络中有175个节点以及360条边。人参、陈皮的主要活性成分有黄酮类、生物碱、甾醇、酯类以及苷类，主要代表性成分有山奈酚（度值63）、β-谷甾醇（度值39）、橙皮素（度值37）、川陈皮素（度值34）、豆甾醇（度值32）、原阿片碱（度值26）、高丽槐素（度值18）、灌木远志酮A（度值17）、人参皂苷rh2（度值13）。

表1 人参、陈皮中的活性成分相关信息

图2 人参、陈皮中的活性成分与靶点作用网络图

2.2 人参-陈皮配伍对慢性阻塞性肺疾病治疗作用靶点分析

通过DrugBank、TTD、GeneCards平台寻找COPD相关靶点基因，整理并筛除重复项，得到800个主要相关靶点基因，将筛选得到的人参、陈皮活性成分的靶点和COPD的靶点通过Venny2.1平台筛选共有靶点，结果见图3。

图3 人参、陈皮活性成分的靶点和慢性阻塞肺疾病靶点韦恩图

2.3 共有靶点PPI网络构建

将70个药物与疾病的共有靶点导入Cytoscape3.6.1软件，利用BisoGenet插件以获取靶点之间相互作用关系，并绘制靶点PPI网络图，进一步研究人参-陈皮配伍治疗COPD的作用机制。利用Cytoscape中的“Analysis Network”工具和CytoNCA插件获取相关参数。基于“度（DC）”、“中间性中心性（BC）”和“亲近性中心性（CC）”三个参数，第一次筛选阈值“BC”＞0.001158，“CC”＞0.444452，“DC”＞117，得到206个节点，5456条边。再经拓扑学分析数据筛选，以“BC”＞0.004664，“CC”＞0.479475，“DC”＞253，得到的网络图有69个节点，715条边，结果见图4。人参-陈皮配伍治疗COPD的靶点中度值排名前10的靶蛋白分别 是AKT1、TNF、TP53、PTGS2、JUN、IL1B、CASP3、MAPK8、NOS3、MAPK1。

图4 共有靶点PPI网络图

2.4 人参、陈皮对COPD相关作用靶点的生物信息学分析

将“2.2”项获取的药物与疾病共有靶点上传至DAVID数据库中进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析（P＜0.01）。在GO富集分析中，共获得265个GO条目，其中生物过程、细胞组分和分子功能模块相关条目分别为190、30和45个，将各条目按Count值从大到小排列，选择排名前10的条目进行可视化分析（图5）。富集分析结果显示，BP过程主要集中在对药物反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、对脂多糖的反应、细胞的老化和凋亡过程等主要通路；CC条目主要集中在质膜、胞质、细胞外空间、细胞外区域等；MF主要集中在蛋白质结合、酶结合、血红素结合、DNA结合等。

图5 富集分析结果气泡图

KEGG富集分析共得到99条信号通路，取Count值排名前20的条目进行可视化分析，结果图6。富集到的通路主要包括TNF信号通路（Count值15）、MAPK信号通路（Count值11）、Toll样受体信号通路（Count值10）、NF-κB信号通路（Count值9）等。研究表明，MAPK信号通路与细胞炎症反应有关，能够激活炎症细胞因子、氧化应激和生长因子。与不吸烟者相比，COPD患者体内巨噬细胞和肺泡壁内其他细胞p38MAPK激活增加。由此可知，MAPK信号活化与肺功能损害程度及肺泡壁炎症相关[35]。以2条信号通路为例，分析人参-陈皮配伍治疗COPD所涉及的信号通路，结果见图7和图8。

图6 KEGG通路富集分析

图7 TNF信号通路

图8 MAPK信号通路

2.5 “药物活性成分-作用靶点-通路”相互作用网络分析

根据KEGG筛选得到的20条代谢通路，反向查找通路基因与之所对应的成分，运用Cytoscape3.6.1软件构建“人参-陈皮活性成分-作用靶点-通路”网络。由图9可知，山奈酚、柚皮素、人参皂苷rh2、川陈皮素、豆甾醇、β-谷甾醇6个成分有较好的连接度；RELA、PTGS2、ATK1、MAPK8、MAPK1、TNF的连接度也高于其他靶点；在20条通路中，癌症信号通路、脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化的连接度相对较高。

图9 药物活性成分-对应靶点-信号通路网络图

2.6 人参、陈皮中的活性成分与AKT1、TNF、PTGS2分子对接结果

选取人参、陈皮中的活性成分如山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、川陈皮素、豆甾醇、人参皂苷rh2、橙皮苷与AKT1、TNF、PTGS2的进行分子对接，结果见表2。靶点AKT1（PDBID:4EJN）、TNF（PDBID:7KP9）、PTGS2（PDBID:4M11）分别与β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素的结合能最小，靶点与活性成分部分分子对接可视化结果见图10。由图10可知，橙皮苷能稳定地对接到AKT1蛋白结构4EJN的活性口袋中（图10-A1）；能够通过氨基酸残基THRA:221,TRPA:80,GLNA:79,LEUA:78产生H键作用；VAIA:270能够产生Pi-sigma键复合作用。橙皮苷也能对接PTGS2蛋白结构4M11的活性口袋中（图10-A2）并与氨基酸残基ABGD:120，TYRD:355，ALAD:527，SERD:530产生H键作用；与VAID:523，LEUD:352产生Pi-sigam键复合作用。

表2 人参、陈皮活性成分与靶点AKT1、TNF、PTGS2的分子对接结果

图10 人参、陈皮活性成分与靶点AKT1、TNF、PTGS2的分子对接结果

2.7 体外抗炎活性结果

肺肾气虚证兼见痰淤是COPD的主要证侯，补肺益肾佐以化痰祛淤是其主要治疗方法，结合化合物靶点作用通路图分析结果，在人参-陈皮中筛选出具有补气、化痰、抗炎功效的代表性成分人参皂苷rh2（度值13）、川陈皮素（度值34）、橙皮素（度值37）、山奈酚（度值63）进行体外抗炎活性测试。体外细胞抗炎结果显示，模型组与空白组相比，细胞因子的含量显著上升，且TIMP-1/MMP-9值明显减小（P＜0.01）。与模型组比较，随着川陈皮素浓度梯度的增加，MMP-9分泌量显著降低（P＜0.01），IL-8分泌量降低（P＜0.01），TIMP-1/MMP-9比值降低。与模型组比较，山奈酚在1.79 µg·mL-1、3.58 µg·mL-1、7.16 µg·mL-1、14.32 µg·mL-1不同浓度范围内均能明显抑制IL-8、MMP-9的分泌，且TIMP-1/MMP-9值升高（P＜0.05）。与模型组比较，柚皮素在3.75 µg·mL-1、7.5 µg·mL-1、15 µg·mL-1、30µg·mL-1不同浓度范围内能明显抑制IL-8、TIMP-1的分泌（P＜0.01）。人参皂苷rh2组IL-8、MMP-9的分泌量降低（P＜0.01）（表3）。体外抗炎活性结果说明，川陈皮素、山奈酚、均能减少Il-8、MMP-9炎症因子的分泌，具有不同程度的抗炎作用，其作用结果与本文网络药理学和分子对接结果相一致，说明人参-陈皮配伍使用具有治疗COPD的作用。

表3 川陈皮素、山奈酚、柚皮素、人参皂苷rh2对炎症细胞模型的影响（xˉ±s，n=4）

3 讨论

本文采用网络药理学及分子对接技术对人参-陈皮配伍使用治疗COPD的作用机制进行研究。人参具有大补元气，补肺益肾之功，人参皂苷可以调节亚油酸、核黄素等激素的生物合成，其配方制剂常用于肺部疾病的防治，对COPD具有良好的防治作用。陈皮具有理气化痰之功，川陈皮素是其代表性成分。由研究结果可知，人参-陈皮配伍可作用于COPD的潜在活性成分主要有β-谷甾醇、山奈酚、柚皮素、川陈皮素、橙皮苷等。经研究发现，β-谷甾醇具有一定的抗炎作用，可降低由脂多糖（LPS）诱导的炎症反应，同时可对LPS所引起的小鼠急性肺损伤有一定的保护作用，其保护机制可能与阻止炎症因子（TNF-α、IL-6）释放和下调NF-κB信号转导通路的活化有关[21]。山奈酚对肺损伤具有防治作用，同时也可降低由病毒所致急性肺损伤小鼠的炎症程度和氧化应激损伤，其机制可能与降低病毒所致急性肺损伤小鼠的炎症程度和氧化应激损伤，可通过下调NF-κB信号通路的表达[22-23]。川陈皮素能够启动Caspase级联反应，改变Bcl-2/Bax的比值，进而抑制肺癌细胞的增殖[24]。柚皮苷有镇咳、祛痰、抗肺部炎症等活性，可抑制人肺癌细胞的增殖和迁移，促进人肺癌细胞的凋亡，其机制可能与其抑制AKT的活化有关[25-26]。

PPI网络分析结果显示，人参-陈皮配伍治疗COPD的 关 键 靶 点 包 括AKT1、TNF、TP53、PTGS2、JUN、IL1B、CASP3、MAPK8、NOS3、MAPK1，上述靶点可以分为炎症因子类、丝裂原活化蛋白激酶类、半胱氨酸蛋白酶类、蛋白激酶类、应激活化激酶类和环氧加酶类等。炎症因子类关键靶点主要包括IL-1B、TNF等，IL-1B可使受体IL-1RI上调，进而促进肺泡巨噬细胞焦磷酸化，最终增强肺部炎症[27]。环氧加酶类靶点包括PTGS2，PTGS2是花生四烯酸合成前列腺的限速酶，可诱导炎症细胞释放趋化因子[28]。半胱氨酸蛋白酶类的靶点包括CASP-3，CASP-3主要参与和控制 细 胞 凋 亡 过 程[29]。MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14属于丝裂原活化蛋白激酶类靶点，其中MAPK通路与肺部炎症疾病的发生发展有关，同时也可参与细胞的分化、增殖及凋亡过程[30]。

KEGG通路分析结果显示，关键靶点主要调控TNF信号通路、凋亡通路、NF-κB信号通路、MAPKs信号通路、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路等。TNF信号通路通过干预与介导炎症反应的发生发展过程诱发机体局部炎症反应，进而造成局部组织器官的损伤[31]。研究发现，COPD患者痰中TNF-α与中性粒细胞和白细胞数量增高存在正相关，TNF-α可刺激中性粒细胞释放细胞酶如弹性酶、蛋白酶等溶解细胞外基质进而诱发体内炎症反应和肺部细胞损伤[32]。NF-κB信号通路参与机体内多种生理生化过程，如炎症发生发展、氧化应激、细胞的凋亡与增殖等过程，是气道炎症的重要参与者，而TNF-α、IL-8、MMP-9等细胞因子的过度表达能激活NF-κB信号通路，COPD的常见致病因素香烟烟雾和细菌脂多糖均可激活NFκB通路引起炎症的发生，提示人参、陈皮可通过抑制NF-κB信号通路的异常活化发挥抗炎作用，从而达到治疗COPD的目的[33][34]。

由分子对接结果可知，山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素和川陈皮素与AKT1、TNF、PTGS2均存在稳定结合位点，其中豆甾醇与AKT1的亲和力最强，说明人参、陈皮可能通过β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇等主要潜在活性成分发挥治疗COPD的作用。体外实验结果表明，不同浓度的山奈酚、川陈皮素、柚皮素、人参皂苷rh2均能减少炎症因子的分泌，说明山奈酚、川陈皮素、柚皮素、人参皂苷rh2具有不同程度的抗炎作用。

综上所述，本文采用网络药理学、分子对接技术以及体外抗炎活性验证，对人参-陈皮配伍治疗COPD的机制进行了探讨和分析，结果显示人参-陈皮配伍对COPD具有一定的治疗作用，为临床上治疗COPD提供新思路和方法。但网络药理学数据整合未有明确的规范，数据库的选择和算法的计算因个人选择而不同，预测结果存在一定的差异。