升清胶囊六种单体对肝细胞氧化应激的影响

李 阳，张静喆，顾宏刚*

（1.郑州人民医院/河南中医药大学人民医院消化内科，郑州 450003；2.上海中医药大学附属龙华医院普外科，上海 200032）

过氧化氢（H2O2）具有很强的氧化性，不仅可以直接氧化细胞膜上的脂质和蛋白质，还可以通过细胞膜与细胞内的铁离子发生反应，生成活性更强的自由基（如OH等），引起一系列氧化应激反应[1]。选用H2O2诱导正常人肝细胞LO2氧化应激模型，研究升清胶囊六种单体对正常人肝细胞LO2氧化应激模型的修复作用，进一步阐明升清胶囊抗氧化能力，筛选其有效单体成分，并分析其安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞人肝细胞LO2（normal human hepatic cell line） 由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.1.2 药物与试剂 98%纯度白藜芦醇苷、白藜芦醇、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸、维生素E（南京泽郎医药科技有限公司）；30% H2O2（上海阿拉丁公司）；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；青霉素、硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钾（国药集团化学试剂有限公司）；噻唑蓝（MTT）（上海谱振生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司）。

1.1.3 药物配置 将升清胶囊（上海中医药大学附属龙华医院院内制剂，沪药制字Z05170981，由生大黄、虎杖、陈皮三味中药组成）的六种单体（白藜芦醇苷、白藜芦醇、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸）和维生素E分别用DMSO溶解，若不能充分溶解，则借助超声波溶解。为了减少对试验的影响，DMSO在含药培养液中的最终体积比最好低于0.1%。

1.1.4 实验仪器 超净工作台（江苏苏净集团安泰公司）；DHG-9203A 型电热恒温干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；电子分析天平、架盘药物天平、精密PH计（上海精密科学仪器有限公司）；ThermoMK3酶标仪、细胞培养箱（美国Thermo公司）；细胞培养板，细胞培养瓶（美国Corning公司）；可调式移液器（德国Eppendorf公司）；Olympus IX71倒置显微镜（日本Olympus公司）；J-301高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；纯水净化仪（美国MiliQ公司）；超声波清洗器（昆山市超声有限公司）；液氮生物容器（成都金凤液氮容器有限公司）；恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；-20℃冰箱（美国ScienTemp公司）；-80℃冰箱（日本三洋公司）。

1.2 细胞培养

正常人肝细胞培养于10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的RPMI 1 640培养基中，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的恒温培养箱，根据生长状况进行传代培养，待细胞生长至约80%融合状态可用于实验。

1.3 实验方法

MTT还原测定法检测细胞活性MTT还原测定法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。噻唑蓝（MTT）是一种可接受氢离子的黄色化合物，作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在细胞色素C和琥珀酸脱氢酶的作用下四唑（tetrazolium）环开裂，还原生成水不溶性蓝紫色的甲臜（formazan）结晶，并沉积在细胞中，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，因此甲臜结晶的生成量与活细胞数目成正比。用DMSO溶解还原生成的甲臜结晶，在490 nm波长处，用酶联免疫检测仪测定光吸收（OD）值，来反映出活细胞数目。MTT法不能测定细胞绝对数，只能用来检测细胞相对活力和相对数。为确保实验结果的线性，采用酶标仪检测结果时，MTT 吸光度的范围最好在0～0.7。

1.4 分组及干预

1.4.1 检测H2O2对肝细胞半数抑制浓度（IC50） 取对数生长期肝细胞，分为正常组和模型组，模型组按 H2O2不同浓度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、400 μm、600 μm、800 μm、1 000 μm）再分为 8 组，每组设6个平行孔。调整细胞悬液浓度，按每毫升1×105细胞接种于96孔培养板，每孔100 μL，边缘孔用无菌PBS填充。置于5%CO2、37℃、饱和湿度的恒温培养箱中培养12 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，模型组加入200 μL含有不同终浓度H2O2的培养液，正常组加入等体积培养液，置于培养箱培养1 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，每孔加入200 μL RPMI-1 640培养液继续培养24 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，每孔加入200 μL含10% MTT的培养液，培养4 h后终止培养，弃上清并用PBS洗涤细胞2次，每孔加入100 μLDMSO，置摇床上振荡10 min，充分溶解甲臜，用酶标仪测定490 nm处的光密度（OD）值，计算细胞的生长抑制率。

1.4.2 升清胶囊六种单体及VE对肝细胞的生长抑制情况的影响 取对数生长期肝细胞，分为正常组和实验组（白藜芦醇苷组、白藜芦醇组、橙皮苷组、大黄酚组、大黄素组、大黄酸组、维生素E组），每个实验组按不同药物浓度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、300 μm、400 μm）再行分组，共 43组，每组设6个平行孔。按每毫升1×105细胞接种于96孔培养板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的恒温培养箱中培养12 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，实验组每组每孔加入200 μL含有不同浓度的白藜芦醇苷、白藜芦醇、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸、维生素E的RPMI-1 640培养液，正常组加入等体积的RPMI-1 640培养液，培养24 h。MTT法测定细胞活性。

1.4.3 升清胶囊六种单体对肝细胞氧化应激的影响 取对数生长期肝细胞，分为正常组、模型组、白藜芦醇苷治疗组、白藜芦醇治疗组、橙皮苷治疗组、大黄酚治疗组、大黄素治疗组、大黄酸治疗组和维生素E对照组，治疗组和对照组按药物不同浓度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm）再行分组，共 30 组，每组设6个平行孔。按每毫升1×105细胞接种于96孔培养板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的恒温培养箱中培养12 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，模型组、治疗组、对照组分别加入200 μL由培养液稀释成终浓度为300 μm的H2O2，正常组加入等体积的培养液，继续培养1 h。培养结束后弃上清并用PBS洗涤细胞2次，治疗组、对照组每组每孔加入200 μL含有不同浓度的白藜芦醇苷、白藜芦醇、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸、维生素E的RPMI-1 640培养液，正常组和模型组加入等体积的RPMI-1 640培养液，培养24 h。MTT法测定细胞活性。

1.5 统计学方法

计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用独立样本t检验方法，数据经SPSS 16.0进行统计，用levene法进行方差齐性检验，行单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较，方差齐用LSD-t法，方差不齐用Tamhane’s T2法，进行显著性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义；以P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞氧化应激模型的建立

肝细胞经H2O2作用后，求得IC50值作为建立模型的浓度。结果见表1、图1。

表1 不同H2O2浓度对肝细胞生长存活情况的影响（±s，n= 70）

表1 不同H2O2浓度对肝细胞生长存活情况的影响（±s，n= 70）

注：与正常组比较，## P＜0.01

组别 浓度/μm 细胞生存率/%正常组 0 100.00±1.88模型组 1 25 94.86±2.12模型组 2 50 89.64±2.45##模型组 3 100 80.09±2.19##模型组4 200 59.20±2.38##模型组 5 400 39.85±2.19##模型组 6 600 24.84±2.07##模型组 7 800 16.64±2.07##模型组 8 1000 5.41±1.08##

图1 不同H2O2浓度对肝细胞存活率的影响

由表1和图1可以求得H2O2的半数抑制浓度为300 μm，此时细胞虽遭受一定程度的损伤，但仍具有活力。因此，后续实验采用H2O2的作用浓度为300 μm、作用时间为1 h的模型条件下展开。

2.2 升清胶囊有效成分及VE的安全性分析

肝细胞经过不同浓度的升清胶囊六种单体及维生素E作用24 h后细胞存活情况如表2、图2所示。

图2 不同药物浓度对肝细胞存活率的影响

表2 不同药物浓度对肝细胞生长存活情况的影响（±s） μm

表2 不同药物浓度对肝细胞生长存活情况的影响（±s） μm

组别 例数 25 50 100 200 300 400白藜芦醇苷组 36 89.56±2.29 85.15±3.01 79.08±3.87 49.96±3.34 41.43±2.98 27.87±2.06白藜芦醇组 36 96.23±2.19 93.25±3.03 86.47±3.43 72.45±2.87 50.54±2.65 29.13±2.67橙皮苷组 36 95.68±1.94 88.42±2.91 85.56±3.28 83.03±3.62 75.15±3.89 48.36±2.83大黄酚组 36 96.75±2.57 91.26±3.32 80.39±3.86 69.65±3.48 48.53±3.09 28.94±2.61大黄素组 36 95.13±2.91 90.28±3.54 83.61±3.78 60.24±3.05 40.03±2.87 19.85±2.69大黄酸组 36 94.81±2.47 84.81±3.06 59.57±3.79 43.82±3.32 33.64±2.95 17.59±1.83维生素 E 组 36 95.48±1.62 93.12±2.33 87.29±3.06 53.34±3.94 38.36±3.21 23.58±1.88正常组 6 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34

由表2和图2可以求得升清胶囊六种单体：白藜芦醇苷、白藜芦醇、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸及对照品维生素E对肝细胞的IC50分别为200 μm、300 μm、390 μm、290 μm、245 μm、155 μm、220 μm。升清胶囊六种单体的IC50均＞150 μm，表明这六种单体对肝细胞的毒性小，安全性高；并且维生素E的IC50也＞200 μm。后续实验采用的药物浓度均在IC50范围内，以保证药物对细胞的毒性降至最低。

2.3 升清胶囊有效成分的筛选

肝细胞经300 μm H2O2作用1 h，采用不同浓度的升清胶囊六种单体及维生素E对H2O2氧化应激模型修复24 h后，细胞存活情况见表3、图3。

表3 不同药物在不同浓度下对H2O2作用的肝细胞生长存活情况的影响（±s） μm

表3 不同药物在不同浓度下对H2O2作用的肝细胞生长存活情况的影响（±s） μm

注：与白藜芦醇治疗组（50 μm）内比较，## P＜0.01；与橙皮苷治疗组（100 μm）内比较，△△ P＜0.01；与大黄酚治疗组（50 μm）内比较，▲▲P＜0.01；与维生素E对照组（50 μm）内比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与大黄酚治疗组（50 μm），■P＜0.05，■■P＜0.01；与橙皮苷治疗组（100 μm）比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

组别 例数 25 50 100 200白藜芦醇苷治疗组 24 57.73±1.44 60.86±1.27■◇◇ 57.49±1.38 39.04±2.51白藜芦醇治疗组 24 62.25±1.82## 68.13±2.49■■◇ 60.35±1.26## 40.84±2.36##橙皮苷治疗组 24 55.18±1.14△△ 0.08±1.91△△■■ 71.22±2.13 61.16±2.39△△大黄酚治疗组 24 59.94±1.22▲▲ 63.85±3.46◇ 59.06±1.36▲▲ 41.93±2.53▲▲大黄素治疗组 24 59.46±0.88 61.13±1.51■◇ 58.58±1.21 38.60±2.52大黄酸治疗组 24 57.80±1.31 9.91±1.29■■◇◇ 56.68±1.63 36.63±1.61维生素E对照组 24 63.24±1.65□ 68.84±4.78■■ 60.75±1.90□ 42.17±2.00□□模型组 6 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77正常组 6 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44

图3 不同药物不同浓度下对H2O2作用的肝细胞存活率影响

由表3和图3可以发现：在25～100 μm范围内，升清胶囊六种单体均有一定的修复作用。当药物浓度为200 μm时，除橙皮苷外，其他药物表现出一定的细胞毒性，不仅没有对损伤细胞修复，反而加重细胞的损伤。在六种单体中，橙皮苷、白藜芦醇和大黄酚对H2O2造成的肝细胞氧化应激有较好的修复作用，以橙皮苷效果最好，白藜芦醇次之，大黄酚再次，均优于大黄素、大黄酸和白藜芦醇苷（P＜0.05或P＜0.01）。橙皮苷的最佳修复浓度为100 μm，其他药物的最佳修复浓度均为50 μm。

3 讨论

升清胶囊由生大黄、虎杖和陈皮三味中药组成。生大黄的主要有效成分为蒽醌衍生物，如大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚及其结合物等。大黄附子汤（RAD）含药血清能改善内毒素诱导的Caco-2细胞氧化应激损伤和炎症反应[2]。虎杖的主要有效成分为大黄素为主的蒽醌类化合物，包括大黄素甲醚、大黄酚、白藜芦醇苷、白藜芦醇、虎杖鞣质、黄酮醇苷类物质和草酸等[3]。现代药理研究显示虎杖有扩血管、抗血栓、抗休克、降血脂、抗感染、抗病毒、保肝、抗氧化的多重作用并且与大黄对降低胆道括约肌的紧张性有协同作用[4]。虎杖提取物（PCE）可能通过靶向Keap1/ Nrf2途径，降低果糖喂养大鼠的氧化应激，防止肝脏脂质积聚[5]。活性氧产生氧化应激并促进结直肠癌的发生，陈皮具有通过诱导Nrf2来抑制细胞氧化应激的能力，从而防止了偶氮甲烷诱导的结肠癌发生[6]。

经研究发现：1）H2O2对肝细胞的半数抑制浓度为300 μm，此时肝细胞受到一定程度的损伤，但仍具有活力。因此，后续实验采用H2O2的作用浓度为300 μm、作用时间为1 h的模型条件下展开。2）升清胶囊六种单体白藜芦醇、白藜芦醇苷、橙皮苷、大黄酚、大黄素、大黄酸的IC50均＞150 μm，表明这六种单体对肝细胞的毒性小，安全性高；维生素E的IC50也＞200 μm；后续实验使用的药物浓度均在IC50范围内，以保证药物对细胞的毒性最小化。3）在25～100 μm范围内，六种单体均有一定的修复作用，白藜芦醇、橙皮苷和大黄酚对H2O2造成的肝细胞氧化应激模型有较好的修复作用，橙皮苷效果最好，白藜芦醇次之，大黄酚再次，均优于大黄素、大黄酸和白藜芦醇苷。4）橙皮苷、白藜芦醇和大黄酚的最佳修复浓度分别为 100 μm、50 μm、50 μm；对照品VE的最佳修复浓度为50 μm。5）当药物浓度在200 μm时，多数单体非但没有表现出修复作用，反而表现出一定的细胞毒性，其原因可能是H2O2增大细胞膜的通透性，相同浓度（200 μm）的药物进入氧化损伤细胞要多于正常细胞，从而造成细胞分裂的减缓和（或）细胞的死亡。6）H2O2对肝细胞半数抑制浓度为300 μm，升清胶囊六种单体对肝细胞的安全性都比较高，对H2O2造成的肝细胞氧化损伤均有一定的修复能力，其中橙皮苷、白藜芦醇和大黄酚有较好的修复作用，其修复作用分别优于、相当、次于VE。后续试验将以橙皮苷、白藜芦醇和大黄酚为三因素进行优化组合，以三者分别最佳修复浓度的2/3、1/3、1/6为高（H）、中（M）、低（L）三个水平，采用正交设计和组分定量技术进行组合，并以VE最佳修复浓度全剂量作为对照展开。