鸡肉中氟喹诺酮类残留液质检测方法比对

周伟靓 福建省农产品质量安全检验检测中心 福州 350003

氟喹诺酮（Fluoroquinolones，FQs）又称新喹诺酮，是一种新型的喹诺酮类（Quinolone，QNs）衍生物，具有吸收性好、抗菌谱广、抗菌作用强、半衰期长、使用方便、价格低廉等优点，在防治动物各类型感染性疾病中被广泛使用。但由于使用过程中不规范用药，近年来耐药率已高达约60%，对人体可造成直接危害甚至致癌。目前对FQs类药物残留的检测方法主要有微生物检测法、色谱仪器分析法、免疫分析法和化学发光与电化学发光分析法等。而液相色谱-串联质谱法特异性更强，具有灵敏度、准确度更高和分析范围更广的特点，适用于鸡肉中FQs类药物残留量的测定。本试验是将国标法液相色谱-串联质谱法测定FQs类药物残留量的前处理步骤进行优化，可在保证检测结果准确性前提下，省时省力、降低检测成本，大幅提高前处理检测工作效率。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和设备 天平（梅特勒-托利多，感量0.01 g）、分析天平（梅特勒-托利多，感量0.00001 g）；冷冻离心机（美国科俊）；固相萃取装置、氮吹仪（美国Organomation）；涡旋混合器（德国IKA）；Waters TQ-S UPLC/MS/MS液相色谱-串联质谱仪（沃特世）；微 孔 滤 头0.22 μm（岛 津）；旋 转 蒸 发 仪（Buchi）。

1.2 试剂、材料 标准品：恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NFX），均购自Dr.公司，纯度均≧98%；色谱纯甲醇（默克公司）、色谱纯乙腈（默克公司）、色谱纯甲酸 （阿拉丁公司）；Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱（200 mg/6cc）、Waters Oasis HLB（200 mg/6cc）；50 mL聚四氟乙烯离心管（Thermo）；鸡肉样品；水为二次蒸馏水。

1.3 试验方法

1.3.1 液相条件 色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm），粒 径：1.7 μm，进 样 量：1 μL，流 速：0.40 mL/min，流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件 扫描方式：多反应离子监测（MRM）；离子源：电喷雾离子源（ESI＋）；离子源温度：150℃；离子源喷雾电压：0.5 kV；雾化温度：350℃；雾化气流速：1 000 L/h；锥孔气流速：150 L/h。监测离子对：恩诺沙星360.2＞245.0（CV/CE 32/20），360.2＞316.1（CV/CE 32/22）；环丙沙星332.1＞288.3（CV/CE 36/17），332.1＞314.2（CV/CE 36/19）；诺氟沙星320.3＞276.3（CV/CE40/17），320.3＞302.3（CV/CE40/19）。

1.3.3 标准工作曲线 取FQs类标准储备液适量，用0.1%甲酸乙腈/水溶液（3/7，v/v）稀释制成浓度分别 为1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的标准工作液，现配现用。依次从低浓度到高浓度测定，按其所得峰面积与对应的对照溶液浓度做标准曲线，得出回归方程及相关系数。恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的回归方程及相关系数表明，在1～200 μg/L浓度呈现良好的线性关系，见表2。

表2 标准曲线的回归方程及相关系数

1.4 前处理方法与步骤

1.4.1 方法一 按照GB/T 20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》前处理方法。

1.4.2 方法二 准确称取（2±0.02）g试料于50 mL离心管内，加入80%乙腈水溶液8.0 mL，涡旋1 min，高 速 振 荡 提 取5 min，9 000 r/min离 心10 min。取上清液4.0 mL直接加载到PRiME HLB固相萃取柱中，无需活化和平衡，保持流速1滴/s，收集全部流出液。于45℃下氮吹至体积小于1.0 mL，用10%甲醇水溶液定容至1.0 mL，涡旋混匀，吸取适量过0.2 μm微孔滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。

2 结 果

2.1 线性范围和最低检测限 配制FQs类标准工作液高、中、低浓度系列，3 d内重复测定3次，得3条标准曲线。结果表明：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星在2.5～500 μg/L浓度具有良好线性关系。恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的最低检出限分别为1.0 μg/kg、1.0 μg/kg、0.8 μg/kg。

2.2 回收率试验 取FQs类标准工作液适量，分别添加至空白鸡肉样品中， 使成10.0 μg/kg、50.0 μg/kg和100.0 μg/kg的加标回收试验，每个浓度平行测定2个，结果见表3。

表3 恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星药物残留加标回收率（n=2）

3 分析与讨论

在采用GB/T 20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》前处理方法时发现，即使用9 000 r/min离心5 min，提取2次，合并上清液至分液漏斗中，部分样品仍存在乳化严重问题，不好液液萃取。分离出下层液后，接着于40℃水浴中旋转蒸发至近干，最后用氮气流吹干，准确加入1.0 mL 2%甲酸乙腈溶液溶解残渣，涡流混匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。方法一前处理6个样品的时间约为6 h，步骤较为繁杂，耗时耗力。经优化后的方法二，样品提取液9 000 r/min离 心10 min，过PRIME HLB固 相 萃 取 柱（200 mg/6cc），收集液经氮吹定容即可直接供上机测定，前处理6个样品的时间约为2 h，大大降低了FQs类残留药物的检测难度，省时省力。在不同浓度梯度的加标回收率试验中，对前处理方法一和方法二分别做单点定量，进行回收率测定对比。加标浓度在10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg时，前处理方法二的回收率在可信范围内，数据稳定可靠，具有良好的分离度和重现性，与GB/T 20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》的试验方法效果相近。

4 结 语

国家农业农村部、国家卫健委、国家市场监督管理总局联合发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定了恩诺沙星+环丙沙星在禽肉中的MRL值为100 μg/kg，农业部第2292号公告规定诺氟沙星在禽肉中禁用。优化后的方法二能够非常方便地对微量浓度的FQs类药物残留进行检测，并能够满足我国目前对FQs类药物残留的常态化检测工作要求，在保证检测结果准确性的前提下，可节约运行成本、保质保量，进一步提升对食品安全的风险预警监测能力。