MC4R基因在5个猪群体内的多态性分析

吴华莉，张莺莺，黄 济，涂尾龙，王洪洋，曹建国，范 春，王胜昌，赵 莹，谈永松

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 闵行 201106；2.上海种猪工程技术研究中心，上海 浦东新区 201302；3.上海实验动物研究中心，上海 浦东新区 201302）

黑素皮质激素受体基因家族（The melanocortin receptor gene family, MCR）由5个位于常染色体上的单外显子组成。在人、小鼠、牛和狗的基因组中MC2R、MC4R和MC5R是共联的，而在猪的基因组中，共联组包括MC1R、MC2R和MC5R。MC4R（黑素皮质激素受体4基因）的变异与脂肪组织沉积相关[1]。MC4R在下丘脑室旁核表达，在食物摄入和能量平衡的中枢控制中起着重要作用[2]。猪MC4R基因定位于1号染色体q22-q27[3]。猪MC4R基因存在一个错义突变（G→A），导致MC4R蛋白第298位天冬氨酸转变成天冬酰胺，该突变与胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、眼肌宽度、眼肌面积、皮率呈显著性相关[4]。MC4R基因多态性与淮猪日增重和活体背膘厚显著相关[5]。本研究检测猪MC4R基因突变位点在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体内的基因型和等位基因频率，以及群体遗传学指标，期望为寻找与猪生长指标相关的分子标记提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验于2022年6—7月在上海市农业科学院畜牧兽医研究所进行。5个猪群体样品中，杜洛克（90头）、长白猪（78头）和大白猪（151头）来自上海祥欣畜禽有限公司，梅山猪（113头）来自于上海猪状元牧场，申农猪（76头）来自上海富民农场，共计508个样品，采用部位为猪耳组织块。PCR试验所用试剂和内切酶ClaⅠ购于宝生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因组试剂盒提取猪耳组织DNA，测定DNA浓度，统一稀释样品浓度为80.0 ng/mL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物及PCR反应条件 上游引物：5'-ATGA ACTCAACCCATCACC-3'；下游引物：5'-TTAATA TCTGCTAGACAAATCACAG-3'[6]。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 27.5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-Free ddH2O 20.5 μL，总体积为50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

1.2.3 基因型分析 猪MC4R基因PCR扩增片段长度为999 bp，存在ClaⅠ内切酶位点。选取PCR扩增条带单一的样品，进行限制性内切酶试验，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。限制性内切酶消化试验的反应体系：PCR产物5 μL，10×Buffer 2 μL，ClaⅠ0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，总体积为16 μL。酶切温度为37 ℃，反应时间为1 h。猪MC4R基因PCR扩增产物经过内切酶消化后产生的不同基因型判定标准见表1。

表1 猪MC4R基因酶切后的3种基因型

1.3 数据统计及分析

计算MC4R基因在5个猪群体内的基因型频率、等位基因频率，计算方法参见参考文献[7]。采用GENEPOP 3.1软件计算基因杂合度（Heterozygosity, He）、纯合度（Homozygosity,Ho）、有效等位基因数（effective number of alleles,Ne）和多态信息含量（polymorphism information content, PIC）。

2 结果与分析

2.1 检测PCR

结果采用琼脂糖凝胶电泳检测MC4R基因PCR结果，如图1所示，目的片段大小为999 bp。

2.2 检测PCR-RFLP结果

采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测内切酶试验结果。如图2所示，AA型为1条带，GG型为2条带，AG型杂合子为3条带。根据电泳检测结果统计MC4R基因在5个群体中的个体基因型。

2.3 猪MC4R基因在5个猪群体内的基因型频率、等位基因频率和群体遗传学指标

由表2可知，MC4R基因在5个猪群体内的基因型频率和等位基因频率表现为：在杜洛克猪群体内检测出AG基因型为优势基因型，AA基因型略少，GG基因型较少，A等位基因为优势等位基因；在长白猪群体内检测出GG基因型为优势基因型，AG基因型略少，少量AA基因型，G等位基因为优势等位基因；在大白猪群体内检测AG基因型为优势基因型，AA基因型略少，GG基因型最少，A等位基因为优势等位基因。在申农猪群体内检测GG基因型为优势基因型，AG基因型较少，少量AA基因型，G等位基因为优势等位基因。在梅山猪群体内检测出GG基因型为优势基因型，AG基因型较少，未检测出AA基因型。

表2 MC4R基因在5个猪群体内的基因型频率、等位基因频率和群体遗传学指标

群体遗传学指标分析结果显示，MC4R基因在杜洛克猪和大白猪群体内PIC值在0.25～0.5之间，表现为中度多态；在长白猪、申农猪和梅山猪PIC值小于0.25，表现低度多态。

3 讨论

黑素皮质激素4受体（MC4R）是一种与体重调节有关的G蛋白偶联受体。人类基因研究已表明MC4R基因的两种移码突变与显性遗传形式的肥胖有关[8]。机体的体重维持是由复杂系统控制的，MC4R是调控猪生产性能性状的候选基因，在基因的高度保守区域发现Asp298Asn突变，并证实该突变位点产生的基因型与猪品系的背膘、生长速度以及总体采食量显著相关[9]。本试验检测在梅山猪，以及培育品种申农猪群体内GG基因型为优势基因型。这与刘桂兰等、强巴央宗等、陈敏等研究证实在中国地方品种群体内GG基因型为优势基因型的结果是一致的[4，10-11]。肖石军等研究证实GG基因型个体的胸、腰和臀部膘厚比AA基因型和AG基因型的厚，GG基因型生长速度快[12]。有研究表明，申农猪和梅山猪的背膘厚比外来品种杜洛克、长白猪和大白猪的要厚[13-18]。由此推测申农猪和梅山猪群体中GG基因型背膘厚可能高于AA基因型和AG基因型，但MC4R基因突变究竟是如何影响群体生长指标的，还需要收集性状加以验证。本试验检测G等位基因在长白猪呈高频分布，而A等位基因在大白猪群体内呈高频分布。这一结果与刘桂兰等、肖石军等研究结果是一致的[4，12]。