基于NF-κB 通路探讨TNF-α 对椎间盘退变小鼠模型髓核间充质干细胞衰老的影响

伍耀宏，陈荣春

（江西省赣州市人民医院，赣州 341000）

椎间盘退变是引起腰腿痛的主要原因，可引起椎间盘细胞数量减少和功能异常[1]。表现为细胞凋亡、细胞外基质成分（蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ,Col Ⅱ））合成与降解失衡,进而导致髓核水分丢失，椎间盘高度下降、椎间盘应力重新分布[2-3]。最终引起纤维环的破裂，退变髓核因压力沿纤维环破口疝出压迫神经并引发相应神经症状[4-5]。此前对于椎间盘突出引起的腰腿痛治疗方法主要包括保守治疗和手术治疗，但会伴随相邻椎间盘退变等并发症，目前尚无十分理想的治疗方法。故实验对椎间盘退变及其加重机制进行研究，有望提高椎间盘退突出的手术疗效。

1 研究对象及方法

1.1 主要试剂和仪器 TNF-α 干细胞诱导培养液、LG-DMEM 培养基（Solarbio,美国）；胎牛血清（FBS）、I 型胶原酶、胰蛋白酶（Biosharp,美国）；细胞增殖试剂盒，NF-κB、Agg、Col II、Sox-9 抗体（ebioscience，美国）；FC500 流式细胞仪、倒置相差显微镜、EXL-800 酶标仪、细胞培养箱（Thermo，美国）。

1.2 实验动物 30 只BALB/c 小鼠，4～6 周龄，18～20 g，购自菲诺克生物科技（上海）有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0005。

1.3 实验方法

1.3.1 椎间盘退变造模及NPSCs 分离培养 采用X 线片定位尾椎椎间隙并标记。小鼠称重，腹腔注射麻醉（1%戊巴比妥钠，35 mg/kg）。麻醉成功后固定小鼠呈俯卧位，碘伏消毒鼠尾，使用21G 定制造模穿刺器械对小鼠尾椎Co6/7、Co8/9 的椎间盘行横贯和半横贯穿刺，穿刺针平行于椎体垂直皮肤进针，从皮肤开始向椎间盘方向半横贯穿刺深度为5 mm，横贯穿刺为10 mm 刚好穿透对侧皮肤，停留30 s 后拔出。在术后4 周腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，分离鼠尾髓核组织剪碎至六孔板内，0.2%二型胶原酶消化、离心漂洗，以10% FBS 重悬混匀并接种于培养瓶，分别加入100 μL 不同浓度TNF-α（0,0.1、1、5、10 ng/mL）培养液，培养7 h，3 d换液1 次。光镜观察细胞，待细胞生长至80%时进行传代，每2 d 更换一次培养液，传代后取P3 代细胞进行实验。用含不同浓度梯度TNF-α（0、0.1、1、5、10 ng/mL）的培养液培养NPSCs，分别列为0 ng/mL TNF-α 组、0.1 ng/mL TNF-α 组、1 ng/mL TNFα 组、5 ng/mL TNF-α 组、10ng/mL TNF-α 组。对NPSCs 三系诱导分化,成脂分化：细胞接种于六孔板内（2×104），待融合至100%进行成脂诱导，3 d 换液1 次，21 d 后油红O 染色观察诱导情况。成骨分化：细胞接种于六孔板内（2×104），待融合80%左右进行成骨诱导，3 d 换液1 次，21 d 后茜素红染色观察诱导情况。成软骨诱导分化：细胞接种于六孔板内（6×105），3 d 换液1 次，21 d 后甲苯胺蓝染色观察诱导情况。

1.3.2 MTT 检测NPSCs 增殖情况 调整细胞悬液浓度，各组每孔加MTT 溶液20 μL，培养4 h 吸去孔内培养液，加入150 μL DMSO 孵育10～20 min，于0、3、5 d 检测各孔吸光值，绘制曲线。

1.3.3 Western-blot 检测NF-κB 蛋白 提取总蛋白，测定浓度，电泳、转模、封闭1 h，加入（1∶1000）一抗（NF-κB，GAPDH），孵育12 h，加入HRP 标记（1∶5000）二抗，孵育2 h，显影，检测NF-κB 蛋白表达水平。

1.3.4 β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老 弃孔板中培养液，PBS 冲洗，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，固定0.5 h。弃固定液，PBS 洗涤3 次加染色液。孵育12 h。去工作液，封片保存。光镜观察衰老细胞数目。

1.3.5 成软骨分化能力检测 利用0，1，10 ng/mL浓度的TNF-α 干预NPSCs，检测相关蛋白表达水平。提取总蛋白测定浓度，电泳、转膜、封闭1 h，加入（1:1000）一抗（Agg、Col II、Sox -9、GAPDH），孵育12 h。加入HRP 标记（1∶5000）二抗，孵育2 h，显影。检测Agg、Col II、Sox-9 蛋白表达水平。

2 结果

2.1 NPSCs 三系分化鉴定 成脂诱导：油红O 染色见细胞内形成脂滴团，有鲜红色脂滴泡；成骨诱导：茜素红染色显示细胞内红染矿化钙盐结节沉积；成软骨诱导：甲苯胺蓝染色观察提示细胞形态不规则，呈现多角形软骨细胞，阴性对照：未见阳性结果，见图1。

2.2 NPSCs 增殖情况 随TNF-α 浓度升高，NPSCs的增殖能力逐渐减弱，与0 ng/mL TNF-α 组比较，其他浓度TNF-α 培养下NPSCs 增殖能力均下降（P＜0.05）。见图2。

2.3 NF-κB 蛋白表达水平 随TNF-α 浓度升高，NF-κB 蛋白表达水平逐渐增高，与0 ng/mL TNFα 组比较，其他浓度TNF-α 培养下NF-κB 蛋白表达水平上调（P＜0.05）。见图3。

2.4 NPSCs 衰老染色情况 随TNF-α 浓度升高，衰老染色阳性细胞数量逐渐增多，与0 ng/mL TNF-α组比较，其他浓度TNF-α 培养下衰老染色阳性细胞数增多（P＜0.05）。见图4。

2.5 成软骨分化能力 三种不同浓度TNF-α 浓度下成软骨分化后Agg、Col II、Sox-9 蛋白表达水平比较无差异（P＞0.05），见图5。

3 讨论

本实验结果表明，随TNF-α 浓度升高，NPSCs的增殖能力降低，NF-κB 蛋白表达水平增高，细胞衰老程度增高。在进行NPSCs 诱导分化后，成脂分化后细胞内形成脂滴团及鲜红色脂滴泡，成骨分化出现大量矿化钙盐结节沉积，成软骨分化细胞呈不规则多角形软骨细胞样，不同浓度TNF-α 成软骨分化后Agg、Col II、Sox-9 水平无差异。

椎间盘退变首先发生于髓核组织，表现为髓核组织脱水，蛋白多糖及ColII 含量减少[6-7]。这一过程伴随炎症反应，TNF-α 在炎症反应中快速合成分泌，调节细胞因子水平[8]。NF-κB 作为TNF-α的下游信号通路，它能够调控DNA 转录过程，参与应激反应[9]。韩亚新[10]研究指出，TNF-α 参与椎间盘退变的发生心及良过程，但与椎间盘退变程度并无联系。而在韩建军[11]的近一步研究中明确了椎间盘退变程度与TNF-α 水平存在相关性，TNFα 越高，椎间盘退变程度越严重。桂辉琼[12]则是通过TNF-α 抑制剂进行研究，发现抑制TNF-α 可有效延缓椎间盘退变，TNF-α 抑制药剂有望成为延缓椎间盘退变的治疗方法，应用前景广阔。而椎间盘退变与NPSCs 密切相关，NPSCs 增殖及分化能力降低，使髓核细胞数量减少，蛋白多糖及Col II分泌减少，导致椎间盘脱水，高度降低，最终引起椎间盘退变。此次实验证实TNF-α 对NPSCs 增殖、分化及衰老均存在影响，从细胞水平说明TNF-α 与椎间盘退变的联系，并通过NF-κB 通路发现TNF-α 引起NPSCs 增殖及分化受阻可能是下调NF-κB 表达有关。Liu[13]及Zhu[14]的研究表明，下调NF-κB 可改善椎间盘退变程度，降低疼痛感，靶向NF-κB 治疗将可作为潜在方法用于椎间盘退变的生物治疗。Agg、Col II、Sox-9 在NPSCs 成软骨分化中逐渐合成，能够作为标志物检测。Agg 是一种复合糖，是结缔组织的纤维成分，可以起到润滑关节的作用[15]。Col II 是由软骨细胞分泌的一种胶原蛋白，保护并联结各组织[16]。Sox-9 是在软骨细胞分化过程中Sox-9 通过翻译后修饰，调节其他细胞因子水平，影响软骨形成[17]。在此次研究中，通过诱导成软骨分化，在检测Agg、Col II、Sox-9 水平后，发现三种不同浓度TNF-α 培养下NPSCs 的Agg、Col II、Sox-9 蛋白表达水平无差别，说明Agg、Col II、Sox-9 可作为NPSCs 分化的检测标志物。陈臻浩[18]在研究中指出，SOX-9 调节组蛋白修饰微小RNA 调控软骨细胞分化，是软骨细胞分化机制之一。结合此次研究，不同浓度TNF-a 作用下NPSCs 成软骨分化后均能够检测出Agg、Col II、Sox-9 且水平无异，可同时作为NPSCs 城软骨分化鉴定的检测标志物。

综上，TNF-α 可进一步降低退变椎间盘来源小鼠NPSCs 的增殖，加快NPSCs 衰老，进一步加速椎间盘的退变进程。NF-κB 通路抑制药剂延缓髓核干细胞衰老有望为椎间盘退变生物 治疗提供新的治疗方法及希望，具有较大的社会和经济效益。