基于网络药理学方法和分子对接技术探讨刺梨治疗高血脂症的作用机制

季嘉城，袁敏艳 ，张 硕，唐 丽 ，王鹏娇 ，张 敏，3，高秀丽，3，4

(1.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室/贵州医科大学药学院，2.贵州医科大学实验动物中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州高等学校微生物与生化药学工程中心，4.贵州省食品营养与健康工程研究中心，贵州 贵阳 550025)

高血脂症(hyperlipidemia)以血清脂质或脂蛋白异常为特征，主要表现为总胆固醇和甘油三酯水平升高[1]。随着现代饮食结构的变化，高脂血症的发病率出现了显著提升，高血脂症已成为一个重要的公共卫生问题[1]。目前，主要用于高血脂症的为他汀类药物、胆汁酸螯合剂等药物，但是长期服用会带来严重如横纹肌溶解、腹泻等不良反应[2-3]。因此，药物的有效性和安全性仍有待探索，新的高血脂症的干预或者治疗策略也有待进一步的发现。

刺梨(RosaroxburghiiTratt)作为一种药食同源民族药，被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》中。刺梨富含各种营养和功能成分，包括黄酮类化合物、维生素C、三萜类化合物、有机酸、多酚类化合物和超氧化物歧化酶[4]。近年来，由于刺梨具有抗氧化、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤的作用[5]，它已引起越来越多的关注。目前，对于刺梨治疗高血脂症研究及作用机制研究比较欠缺。本研究结合药效学实验和网络药理学-分子对接，初步探索了刺梨对高血脂症的治疗作用和可能的作用机制，为深入研究药效物质基础、作用机制以及临床应用提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 刺梨降血脂作用研究

1.1.1高血脂大鼠模型的构建 刺梨原汁由“贵农5号”鲜果压榨得到，采用比色法和HPLC法(Agilent Technologies，USA)测定总多酚含量为(31.26±0.13) g·L-1、总黄酮含量为(9.59±0.15) g·L-1、总多糖含量为(14.52±0.20) g·L-1、维生素C含量为(13.45±0.09) g·L-1。雄性Sprague-Dawley大鼠(180～200 g，SPF)购自贵州医科大学动物中心(许可证号：SYXK(黔)2018-0001)，实验所用刺梨均为同一型号、同一批次。动物实验得到了贵州医科大学动物实验中心和贵州医科大学动物伦理委员会的批准，并按照国家实验动物福利和动物实验伦理要求的准则进行。18只SD大鼠适应性饲养1周，将18只随机分为空白组(n=6)和高脂组(n=12)，空白组喂普通饲料，高脂组大鼠高脂饲料喂养8周，高脂饲料(18%猪油、2%胆固醇、0.2%胆汁盐和79.8%基础饲料)，血清TG、TC水平与空白组具有显著性差异，视为造模成功。造模期间自由饮食饮水，造模成功大鼠分为2组(n=6)，分别为模型组和刺梨组，根据大鼠体重调整灌胃剂量，刺梨组给予刺梨原汁灌胃10 mL·kg-1，模型组与空白组灌胃等量生理盐水。空白组给予基础饲料，模型组和刺梨组给予高脂饲料。实验期间大鼠自由饮食饮水，每周记录体重，治疗周期为3个月。

1.1.2理化指标测定 将血样在室温(24±2) ℃下放置1 h，在4 ℃下以3 000 r·min-1离心10 min，分离血清并储存在-20 ℃。血清脂质指标包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)(南京市建成生物工程研究所，中国南京)使用商业试剂盒进行测量。

1.1.3肝脏组织切片分析 解剖摘取各组大鼠肝脏，经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片、染色、封片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肝脏组织结构。

1.2 刺梨治疗高血脂症网络药理学分析

1.2.1刺梨的活性成分库建立 由于中草药系统药理学平台(TCMSP)数据库未收录“刺梨”，根据已发表的有关刺梨成分的文献，书籍，并结合中药与化学成分数据库(http：//www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp)，收集了刺梨的化学成分。利用PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找收集的化学成分的2D结构的SDF文件，将该文件导入SwissADME(http：//www.swissadme.ch)了解成分的胃肠道吸收性、类药性以及能否穿透血脑屏障，筛选条件：GIabsorption为Yes、Druglikeness(包括Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)5项特性中3项为Yes；符合筛选条件的有效成分。通过SwissTargetPrediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)数据库搜集的作用靶点。利用UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/)对所有靶基因名称进行校正，获得靶点信息。

1.2.2靶点库建立 以“Hyperlipidemia”为检索词，对DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca)、Online Mendelian Inheritance in Man Database(OMIM)数据库(https：//www.omim.org)、GeneCards数据库(https：//www.genecards.org)进行检索，合并数据库的过滤结果，删除重复靶点，获得高血脂症相关基因靶点。

1.2.3刺梨降血脂潜在靶点的预测 利用在线工具Venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对刺梨的作用靶点与高血脂相关基因靶点互相映射，得到二者的交集靶点，即刺梨降血脂的潜在靶点。

1.2.4蛋白-蛋白相互作用网络的构建和关键靶点的筛选 将刺梨治疗高血脂的潜在靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org/)构建PPI网络。蛋白物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“high confidence>0.9”，并隐藏游离的靶标，其余参数保持默认设置，得到靶蛋白之间的PPI网络图及相互信息数据表，利用Cytoscape3.7.2软件中Network Analyzer插件对以上结果进行网络拓扑参数分析。

1.2.5“中药-活性成分-潜在靶点”网络的构建 将刺梨的主要活性成分与潜在靶点导入Cytoscape3.7.2软件中，绘制“中药-活性成分-潜在靶点”网络。

1.2.6关键靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析 使用DAVIDV6.8数据库(https：//david.ncifcrf.gov)对潜在的治疗靶标基因进行基因本体(Gene Ontology，Go)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，获得刺梨治疗高血脂的生物学过程、细胞组分、分子功能和相关信号通路关系。

1.2.7分子对接 通过Pubchem网站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索获取化合物的SDF结构文件，并利用Open Babel 2.3.2软件将SDF文件转化为PDB文件，从Protein Data Bank (http：//www.rcsb.org/pdb)数据库中检索获得受体蛋白RXRA(PDB：3NSQ)、AKT1(PDB：4EKL)、ESR1(PDB：5GS4)、PIK3R1(PDB：4WAF)，利用PYMOL 2.3.4软件对受体蛋白进行去水、去配体等操作，采用AutoDockTools软件对受体蛋白进行加氢、平衡电荷等修饰，利用AutoDock Vina 1.1.2对受体蛋白与配体小分子进行分子对接，结合能打分。

2 结果

2.1 刺梨降血脂作用研究

2.1.1刺梨对血脂的影响 由Tab 1知，与空白组比，模型组血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明显升高(P<0.05)，HDL-C水平明显下降(P<0.05)，表明高脂饲料喂养的大鼠出现血脂异常。经刺梨治疗后，与模型组比，刺梨组TC、TG、LDL-C水平明显下降(P<0.05)，HDL-C水平明显增加(P<0.05)，与空白组相比差异无显著性(P>0.05)。以上研究结果表明，刺梨能明显改善高脂饲料诱导的大鼠血脂异常、维持血脂水平稳定。

Tab 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on body weight and serum biochemical index of

2.1.2刺梨对肝脏功能的影响 肝脏指数在一定程度上可以反映肝脏的健康状况。高血脂组的肝脏指数均明显高于空白组(P<0.05)，说明脂肪在肝脏积聚较为严重，给药刺梨后，肝脏指数明显降低，见Tab 1。HE染色显示，模型组肝小叶结构严重紊乱，只有少部分肝小叶结构正常，脂肪空泡占整个视野区域面积小于3/4，脂肪空泡相互融合成片；脂肪空泡集中区域部分肝细胞体积增大，细胞质着色浅，部分细胞坏死，细胞核溶解。经过刺梨治疗后肝小叶清晰可见，肝细胞间分布的大小不等的脂肪空泡减少(Fig 1)。结果表明，刺梨汁能显著改善高脂饲料诱导的大鼠肝脏功能的损伤。

2.2 网络药理学及分子对接

2.2.1刺梨活性成分及相关靶标获取 通过已发表的有关刺梨成分的文献，并结合中药与化学成分数据库检索得到主要活性化合物14个，槲皮素、棕榈酸、原儿茶酸、没食子酸、丁香酸、4-羟基苯甲酸、咖啡酸、鞣花酸、山奈酚、月桂酸、β-谷甾醇、Roxburic acid、α-亚麻酸、4-羟基肉桂酸，共对应347个靶标。

2.2.2高血脂相关靶标筛选和交集靶标获取 将Genecard数据库、OMIM数据库和Drugbank数据库检索到的高血脂的靶标结果合并，去除重复值，获得高血脂相关基因疾病靶点1 489个，使用Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对347个刺梨药物靶点与1 489个高血脂相关基因靶点进行互相映射，获得129个刺梨治疗高血脂症的交集靶点，如Fig 2。

2.2.3“中药-活性成分-潜在靶点”网络 将交集靶点、活性成分、中药信息导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析处理，获得“中药-活性成分-潜在靶点”网络图，如Fig 3。

2.2.4PPI网络和关键靶点 将刺梨治疗高血脂症的129个潜在靶点导入STRING数据库，限定物种为Homo Sapiens，设置最低置信度为0.9，同时隐藏游离的点，靶蛋白相互作用信息导入Cytoscape3.7.2软件中，进行可视化分析，构建PPI网络关系图，见Fig 3，该网络关系图中，包含104个节点和534条边。利用“Analyze Network”功能对PPI网络进行拓扑分析，计算出各节点的度值(degree)、介数中心性(Between nesscentrality，BC)和接近中心性(Closeness centrality，CC)，其中degree的中位数为4，BC的中位数为0.0049，CC的中位数为0.3055，以degree≥4且BC≥0.0049且CC≥0.3055为筛选出符合的靶蛋白有30个，即为刺梨治疗高血脂的关键靶点，见Fig 4和Tab 2。按照度值对关键靶蛋白进行排序，将前4个靶点作为核心靶点即RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1。

Fig 1 HE staining of liver tissues of rats(×20)A:Control;B:Model;C:Rosa roxburghii Tratt

Fig 2 Venn diagram of Rosa roxburghii Tratt hyperlipidemia target

Fig 3 Traditional Chinese medicine -active ingredients-potential therapeutic targets

2.2.5GO富集分析 为进一步阐明交集靶点的潜在作用，本研究通过对交集靶点进行富集分析。运用David数据对刺梨降血脂的潜在靶点进行GO生物学过程富集分析。GO包括生物学过程(BP)，分子功能(MF)以及细胞组分(CC)，共富集到262条GO条目，其中包括190条生物学过程，54条分子功能和18条细胞组分，见Fig 5。生物学过程涉及RNA聚合酶II启动子转录的正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II pro-moter)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、信号传导(signal transduction)、类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediated signaling pathway)、蛋白质磷酸化的正向调控(positive regulation of protein phosphorylation)等。

Fig 4 Protein interaction network of therapeutic targets of Rosa roxburghii Tratt

Tab 2 Key protein topological parameters of protein-protein interaction network

Fig 5 GO functional enrichment analysis

2.2.6KEGG富集分析 KEGG分析主要涉及癌症通路(Pathways in cancer)、癌症蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)、非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcoholic fatty liver disease)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、TNF-信号通路(TNF signaling pathway)等，见Fig 6。

Fig 6 Top20 of KEGG enrichment result

2.2.7分子对接 从成分-核心靶点网络中将基因靶点以 degree 值高低进行排序，选取前4个关键靶点(RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1)，分别与刺梨治疗高血脂症的2个关键药效成分(Roxburic acid和α-亚麻酸)进行分子对接，对接结合能如表Tab 3所示。2个关键药效成分与4个靶标蛋白的结合能均小于0，其中刺梨酸与4个关键靶点的结合很好，均小于-5 kcal·mol-1，提示分子间具有很好的结合活性。其对接结果进行可视化如Fig 7所示，见Tab 3。通过Discovery Studio和 PyMOL对结合能最低的组合进行相互作用模式分析，受体蛋白AKT1与Roxburic acid配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Asp292、Asp274与Roxburic acid配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Lys276、Thr312、Leu295、Gly311、Cys310、Phe309、Glu191、Phe161与Roxburic acid配体小分子形成疏水相互作用，共同维持和AKT1之间的稳定构象。

Tab 3 The docking score of Rosa roxburghii Tratt active component and target protein

3 讨论

本文通过构建高血脂大鼠模型，研究刺梨对高血脂大鼠的治疗作用，结果表明，刺梨明显降低了高血脂症大鼠体重，血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明显(P<0.05)，明显提高了HDL-C水平(P<0.05)，同时刺梨显著改善了高血脂饮食引起的肝脏功能的损伤，综上所述，刺梨具有很好的治疗高血

Fig 7 Molecular docking model of Roxburic acid with target proteinA：Docking results of AKT1-Roxburic acid;B：Docking results of ESR1-Roxburic acid;C：Docking results of RXRA-Roxburic acid;D：Docking results of PIK3R1-Roxburic acid

脂症的作用。

本研究共筛选出刺梨活性成分14个，其中主要活性成分有Roxburic acid、α-亚麻酸、山奈酚、槲皮素、鞣花酸等，α-亚麻酸是一种主要来源于植物的ω-3多不饱和脂肪酸，补充α-亚麻酸可明显改善血脂水平，降低心血管疾病的风险[6-7]；山奈酚通过调节脂质代谢、增加能量消耗来改善肥胖[8-9]；槲皮素对肥胖、脂代谢、糖代谢和氧化应激均有明显的影响[9]；鞣花酸具有改善血脂异常、抗肿瘤、抗突变及抗炎等作用[10]。

通过PPI 网络拓扑分析得出30个核心靶点，涉及RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等30个核心靶点，对30个核心靶点进行GO功能和 KEGG 通路富集分析。KEGG 富集通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信号通路、TNF-信号通路等，这些通路在调节能量代谢中发挥着重要的作用。

本研究将筛选出的核心成分与关键靶点分子对接，2个关键药效成分与4个靶标蛋白的结合能均小于0，提示刺梨中的核心成分与关键靶点有着较好的结合活性，说明它们可能是治疗高血脂症的潜在活性成分。RXRA是核配体激活转录因子家族成员，参与脂肪酸代谢、胆固醇代谢等多个生物过程，调节脂质代谢中的稳态[11-12]。ESR1介导SCL2A4基因表达来影响着脂肪的正常转化，从而发挥调节血糖代谢紊乱的作用[13-14]。AKT1和PIK3R1通过影响PI3K/AKT信号转导通路中发挥着调节能量稳态，调节脂肪酸合成的作用[15-17]。分子对接结果显示，RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1与Roxburic acid与α-亚麻酸具有很好的结合，其中Roxburic acid 与RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1具有更好的结合，Roxburic acid作为五环三萜类化合物[18]，目前还缺少对它的研究报告，分子对接的结果显示，Roxburic acid在刺梨降血脂中可能发挥着重要的作用，还需我们进一步的研究与探索。

综上所述，本研究通过构建高血脂大鼠模型，研究了刺梨对高血脂症的治疗作用，运用网络药理学分析和分子对接验证，预测出刺梨治疗高血脂症的作用靶点和主要信号通路。其中关键作用靶点有RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等，关键通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信号通路、TNF信号通路等。刺梨对高血脂症具有很好的治疗作用，同时通过影响着多靶点、多个相关通路来发挥降低血脂的作用，这也为我们后续的作用机制进一步探索提供一定的参考。