基于Box-Behnken设计-效应面法优化姜黄素-乳铁蛋白纳米粒制备工艺和体外评价研究

李岭慧，廖 婉#，张 倩，余方坤，谭立伟，李章才，胡琼丹，张心洁，廖洋样，侯曙光, *，李 锐*

·药剂与工艺·

基于Box-Behnken设计-效应面法优化姜黄素-乳铁蛋白纳米粒制备工艺和体外评价研究

李岭慧1, 2，廖 婉1, 2#，张 倩1,2，余方坤1, 2，谭立伟3，李章才3，胡琼丹1, 2，张心洁1, 2，廖洋样1, 2，侯曙光1, 2, 3*，李 锐1, 2*

1. 成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137 2. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137 2. 四川普锐特药业有限公司，四川 成都 610041

运用Box-Behnken设计-效应面法优化姜黄素-乳铁蛋白纳米粒（curcumin-lactoferrin nanoparticles，Cur-LF-NPs）的制备处方工艺。采用去溶剂化法制备Cur-LF-NPs，基于单因素实验结果，选择反溶剂/溶剂体积比、乳铁蛋白/ 姜黄素投料比和pH值作为后续Box-Behnken设计优化实验的考察因素；以包封率、粒径和多分散系数经CRITIC权重分析计算后得到的综合评分作为评价指标，使用Design Expert 10软件对数据进行拟合并验证优化后的处方工艺。最后对纳米粒形态、粒径电位、载药能力、稳定性及体外释放行为等进行表征评价。经优化后的制备工艺条件为反溶剂/溶剂体积比16∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比8∶1、pH值为6。Cur-LF-NPs粒径为（72.6±5.2）nm、PDI为0.084±0.015、ζ电位为（24.5±3.7）mV，包封率（94.8±1.6）%、载药量（10.2±0.5）%。Cur-LF-NPs体外释放相较于姜黄素原料药具有一定的缓释效果。经Box-Behnken设计-效应面法筛选获得制备Cur-LF-NPs的最佳处方工艺，该制剂粒径均一、载药能力强、稳定性好，为后续的体内外研究提供稳定的制剂基础。

姜黄素；乳铁蛋白纳米粒；Box-Behnken设计-效应面法；CRITIC权重分析；制备工艺筛选

姜黄素主要来源于姜科姜黄属多年生草本植物姜黄L.的根茎[1]。作为世界公认的药食同源物质之一，姜黄素既可作为食品调味剂和着色剂[2]，也有研究报道其具有抗氧化、抗炎、促进肿瘤细胞凋亡和神经保护等药理活性[3]。基于明确的神经保护药效作用，姜黄素被广泛开展于如阿尔茨海默症[4]、帕金森病[5]及脑缺血[6]等脑神经退化/损伤疾病治疗的研究。然而，与大多数天然活性化合物相似，水溶性差、口服生物利用度低等成药性缺陷限制了姜黄素在临床中的应用。不仅如此，对于脑部疾病，游离药物靶向性缺失及特殊的生理屏障-血脑屏障（blood brain barrier，BBB）[7]则进一步限制药物进入脑部发挥药效。近年来，纳米载药技术的发展为药物的脑靶向递送提供了一系列研发策略，如脂质体[8]、微乳液[9]、胶束[10-11]等纳米制剂和细胞穿膜肽（CPPs）[12]、膜转运蛋白[13]（如转铁蛋白和乳铁蛋白）等修饰技术均有效提高了药物在脑组织的富集。其中，作为人体内源性物质的乳铁蛋白，不仅可实现对于BBB的高效透过[14]及神经损伤部位的主动靶向[15]，还因其来源广泛[16]、可结合基团多[17]、生物相容性高[18]等优点，具有成为药物脑部递送候选载体的潜力。

乳铁蛋白是相对分子质量约为80 000的单体糖蛋白，等电点（PI）为8.0～8.5[19]。将其作为纳米载体包载姜黄素治疗神经退行性疾病有多方面优势。其一，乳铁蛋白生物相容性高，是具有营养价值的美国GRAS认证原料[20]；其二，乳铁蛋白具有脑靶向作用，乳铁蛋白受体在脑内皮细胞和与神经退行性疾病相关的神经元中高度表达[21]；其三，乳铁蛋白具有改善神经系统的功能。衰老和神经退化的大脑中含有较高水平的铁，其作为铁转运蛋白能够通过与铁的螯合作用来减轻氧化应激反应和改善铁代谢来保护神经系统[22]。综上所述，将姜黄素包载于乳铁蛋白中有助于实现其脑组织高效递送及两者在神经损伤中的协同治疗作用。

尽管目前关于乳铁蛋白纳米粒的制备方法已有相关报道，但制备工艺中非药用交联剂[23]、有毒有机试剂的使用[24]，使制剂的安全性有待商榷。因此，本研究采用去溶剂化法制备姜黄素-乳铁蛋白纳米粒（curcumin-lactoferrin nanoparticles，Cur-LF-NPs），通过Box-Behnken设计-效应面法筛选提供了一种简单、安全的处方工艺，并制备出粒径均一、载药能力强、稳定性好的Cur-LF-NPs，以期为后续的体内外评价建立制剂基础。

1 仪器与材料

Agilent 1260 Infinity II型高效液相色谱仪（HPLC），美国Agilent公司；XS205DU型十万分之一电子天平、S210型pH计，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；WH620型加热磁力搅拌器，WIGGENS公司；Biosafer 900-92型超声波细胞破碎仪，南京赛飞生物科技有限公司；TG-1850型台式高速离心机，上海锦玟仪器设备有限公司；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHA-C型水浴恒温振荡器，江苏科析仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，德国Merck公司；NanoBrook 90 Plus PALS粒度仪，美国Brookhaven公司；HT7800型透射电子显微镜（TEM），日立公司；Victor Nivo型全自动酶标仪，PerkinElmer公司。

乳铁蛋白（批号A16GS145363，质量分数95%）、甘露醇（批号M24GS149532，AR级）、海藻糖（批号S28J12H138585，BR级）均购自上海源叶生物科技有限公司；姜黄素（批号C12811019，AR级）购自成都麦克林生物科技有限公司；姜黄素对照品（批号PS012299，质量分数98.5%）购自成都普思生物科技股份有限公司；CE型透析袋（相对分子质量8000～10 000），冰醋酸、乙腈和甲醇为HPLC级，无水乙醇为AR级，购自成都科隆化学品有限公司。

2 方法与结果

2.1 Cur-LF-NPs溶液的制备

参考Hasanpoor等[25]报道的去溶剂化法制备Cur-LF-NPs。称取48 mg乳铁蛋白超声溶于16 mL超纯水中，加入5%柠檬酸钠调节pH值至6，冰箱放置过夜以充分溶解，为反溶剂相；将6 mg姜黄素超声溶于1 mL无水乙醇中，为溶剂相。使用注射器将姜黄素乙醇溶液以1 mL/min的速率缓慢地滴入磁力搅拌（400 r/min）中的乳铁蛋白溶液，随后在探针超声仪上匀化制得的纳米粒（功率900 W，振幅10%，开2 s、关3 s，循环2 min）。最后通过4000 r/min离心10 min以分离游离姜黄素，上清液过0.22 μm微孔滤膜即得Cur-LF-NPs溶液。空白LF-NPs的制备除不加姜黄素外同法制备。

2.2 包封率、载药量的测定

2.2.1 离心沉淀-滤膜法测定包封率 姜黄素极难溶于水，未包封的游离药物常以微晶的形式存在于溶液中[26]，故通过离心联合滤过的方式除去游离姜黄素。具体操作方法为取1 mL“2.1”项下探针超声前的Cur-LF-NPs置于20 mL量瓶中，加入适量甲醇超声破坏纳米粒，冷却后加甲醇定容，采用HPLC法测得的药物质量浓度为加入药物总量（t）；吸取“2.1”项下离心-过膜后的Cur-LF-NPs 1 mL同上法处理后测得的质量浓度为被包封药物的量（e），包封率按下列公式求得。

包封率＝e/t

2.2.2 载药量 将Cur-LF-NPs冷冻干燥48 h后储存于棕色干燥器中，备用。精密称取Cur-LF-NPs冻干粉（总）至20 mL量瓶中，加入适量甲醇超声破坏纳米粒，冷却后加甲醇定容，采用HPLC法测得的质量浓度为冻干粉中药物的量（药），载药量按下列公式求得。

载药量＝药/总

2.3 方法学考察

2.3.1 色谱条件 色谱系统为Agilent 1260 Infinity II型HPLC系统；色谱柱为Aglient Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相为4%冰醋酸-乙腈（52∶48）；检测波长430 nm；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μL；保留时间7.8 min左右；理论塔板数大于12 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取姜黄素对照品24.00 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，配制成质量浓度为472.8 μg/mL的对照品母液。移取相应体积的对照品母液，用甲醇稀释配制成质量浓度分别为0.76、3.78、18.91、47.28、70.92、94.56、141.84 μg/mL的一系列对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取1 mL“2.1”项下的Cur-LF-NPs溶液至50 mL量瓶中，加入适量甲醇超声破坏纳米粒，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度线，即得；空白LF-NPs供试品溶液同法制备。

2.3.4 专属性考察 分别取空白LF-NPs供试品溶液、Cur-LF-NPs供试品溶液和姜黄素对照品溶液按“2.3.1”项下色谱条件进行测定。色谱图见图1，空白LF-NPs供试品溶液未出现干扰峰，且Cur-LF-NPs供试品溶液和姜黄素对照品溶液出峰时间一致，证明该色谱方法专属性良好。

图1 空白LF-NPs溶液(A)、Cur-LF-NPs供试品溶液(B)和姜黄素对照品(C) 的HPLC图

2.3.5 线性关系考察 将“2.3.2”项下配制的0.76、3.78、18.91、47.28、70.92、94.56、141.84 μg/mL一系列对照品溶液按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品溶液质量浓度为横坐标（），对应的峰面积为纵坐标（），得线性回归方程＝58 893－20 895，2＝0.999 8，结果表明姜黄素在0.76～141.84 μg/mL线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 取低、中、高质量浓度（0.76、47.28、141.84 μg/mL）的姜黄素对照品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件，在同一天9:00、15:00、21:00时，将每个质量浓度连续进样3次，计算不同时间点间峰面积的RSD值，分别为0.72%、0.12%、0.18%，可见日内精密度良好。连续3 d在9:00时将每个质量浓度连续进样3次，计算3 d间峰面积的RSD值，分别为0.89%、0.44%、0.46%，可见日间精密度良好。

2.3.7 重复性试验 取新鲜制备的Cur-LF-NPs溶液，按“2.3.3”项下方法平行制得6份供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析。结果显示姜黄素平均质量浓度为298.6 μg/mL，RSD为0.48%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性试验 取“2.3.4”项下方法处理后的供试品溶液，于0、6、12、24、48 h进样测定姜黄素含量，计算其RSD为1.48%，结果显示供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.9 加样回收率试验 按“2.1”项下方法配制一定质量浓度的Cur-LF-NPs供试品溶液，精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，超声破坏纳米粒后用甲醇稀释至刻度线，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算供试品质量浓度。取9份1 mL上述供试品溶液分别置于10 mL量瓶中，分为3组，每组3份；分别加入1 mL 70.92、94.56、141.84 μg/mL姜黄素对照品溶液，同上法破坏纳米粒后进样测定，计算姜黄素的加样回收率。结果显示，各组样品的平均回收率分别为96.3%、95.1%、96.1%，RSD分别为1.07%、1.03%、0.95%，可见本实验回收率良好。

2.4 单因素实验

根据前期预实验结果，对反溶剂/溶剂体积比、乳铁蛋白/姜黄素投料比、pH值、磁搅转速、超声时间和超声功率进行单因素考察实验，以包封率和粒径作为评价指标，为后续Box-Behnken设计优化实验初筛对Cur-LF-NPs制备过程中影响较大的实验因素。

2.4.1 反溶剂/溶剂体积比 固定乳铁蛋白/姜黄素投料比10∶1，pH值为6、磁搅转速400 r/min、探针超声（45 W、2 min）。考察反溶剂/溶剂体积比为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1时对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表1。文献数据[27]表明，乳铁蛋白具有亲水区和疏水区，姜黄素主要依靠疏水作用力和氢键作用力与之结合。制备过程中，药物分子需要进入靶标蛋白结合空腔，因此，加入适量的乙醇可以与存在于靶标蛋白结合空腔中的水形成氢键，以促进空腔中水分子的外排[28]，从而增加姜黄素与靶标蛋白结合空腔的缔合效率，提高药物包封率。然而，制备体系中如果存在大量的乙醇便会与蛋白质之间形成氢键，从而破坏其内部原有的氢键结构使蛋白质变性[29]，引起蛋白质沉淀、溶液浑浊，药物包封率降低。由表1可知，当反溶剂/溶剂体积比小于4∶1时，体系中含有较大比例的乙醇，包封率较低；随着反溶剂/溶剂体积比增加至8∶1及以上时，包封率显著增大；当反溶剂/溶剂比超过16∶1时，体系中较低的乙醇含量不能提供足够的去溶剂化能，即无法较好地排出靶标蛋白结合空腔中的水使更多的姜黄素进入其内，故包封率出现降低。本实验结果表明，反溶剂/溶剂体积比为12∶1时包封率最高，且8∶1～16∶1粒径变化趋势不明显，因此，选择这一范围进行后续Box-Behnken设计优化实验。

表1 反溶剂/溶剂体积比考察(, n = 3)

Table 1 Investigation of anti-solvent/solvent volume ratio (, n = 3)

反溶剂/溶剂体积比包封率/%粒径/nm 4∶148.2±3.6168.2±12.5 8∶189.6±1.5124.5±5.8 12∶195.8±0.6119.3±3.4 16∶192.6±1.8114.5±5.6 20∶187.1±2.3131.6±8.2

2.4.2 乳铁蛋白/姜黄素投料比 固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、pH值为6、磁搅转速为400 r/min、探针超声（45 W、2 min）。考察乳铁蛋白/姜黄素投料比为6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表2。随着乳铁蛋白/姜黄素投料比不断增大，纳米粒包封率呈增大的趋势，粒径呈减小的趋势。当投料比为8∶1～14∶1时，纳米粒包封率和粒径变化皆趋向平稳，包封率在87.2%～96.4%，粒径为96.2～135.5 nm。同时考虑到乳铁蛋白/姜黄素投料比影响纳米粒的载药量，故选择乳铁蛋白/姜黄素投料比为8∶1～12∶1进行后续Box-Behnken设计优化实验。

表2 乳铁蛋白/姜黄素投料比考察(, n = 3)

Table 2 Investigation of lactoferrin/curcumin weight ratio (, n = 3)

乳铁蛋白/姜黄素投料比包封率/%粒径/nm 6∶168.2±3.2184.6±8.3 8∶187.2±1.4135.5±5.3 10∶191.8±1.2116.8±9.2 12∶195.1±0.3102.3±2.8 14∶196.4±0.296.2±1.2

2.4.3 pH值 固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比10∶1、磁搅转速400 r/min、探针超声（45 W、2 min）。考察pH值4、5、6、7对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表3。当pH值从4变化至6时，包封率逐渐增大；从pH值6变化至7时，包封率出现下降，原因可能是姜黄素的酚羟基在靠近中性至碱性条件下不稳定造成的。且pH值为6时纳米粒粒径最小，故选择pH值范围为5～7进行后续Box-Behnken设计优化实验。

表3 pH值考察(, n = 3)

Table 3 Investigation of pH values (, n = 3)

pH值包封率/%粒径/nm 468.4±3.4133.5±5.5 582.3±2.3162.4±6.2 691.8±1.2123.3±3.8 786.1±2.6149.5±4.2

2.4.4 磁搅转速 固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比10∶1、pH值为6、探针超声（45 W、2 min）。考察磁搅转速200、400、600、800 r/min对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表4。磁搅速度对包封率无显著影响；当磁搅转速从200 r/min增至400 r/min时，粒径明显减小，继续增加磁搅速度对粒径无显著影响。故选择磁搅速度为400 r/min。

2.4.5 超声时间 固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比10∶1、pH值为6、磁搅转速400 r/min、探针超声功率为45 W。考察超声时间0、2、5 min对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表5。探针超声2 min与不超声相比，包封率略降低，粒径因为超声强烈的剪切作用而变小；但超声5 min时，较长的超声时间破坏了纳米体系的稳定性使药物泄漏，导致包封率明显降低、粒径显著增大，故选择超声时间为2 min。

表4 磁搅转速考察(, n = 3)

Table 4 Investigation of magnetic stirring speed (, n = 3)

磁搅转速/(r∙min−1)包封率/%粒径/nm 20091.2±1.6143.3±6.2 40094.3±1.3122.1±3.5 60091.8±1.5123.8±3.6 80092.2±2.8118.6±2.3

表5 超声时间考察(, n = 3)

Table 5 Investigation of ultrasonic time (, n = 3)

超声时间/min包封率/%粒径/nm 093.2±.6116.8±4.6 292.7±1.5101.2±2.9 585.1±1.2146.6±7.3

2.4.6 超声功率 固定反溶剂/溶剂体积比12∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比10∶1、pH值为6、磁搅转速400 r/min、探针超声时间2 min。考察超声功率45、90、180 W对Cur-LF-NPs包封率和粒径的影响，结果见表6。超声功率对包封率和粒径的影响，同超声时间影响结果类似，故选择超声功率为90 W。

表6 超声功率考察 (, n = 3)

Table 6 Investigation of ultrasonic power (, n = 3)

超声功率/W包封率/%粒径/nm 4592.5±1.8112.8±5.2 9095.9±0.2104.3±3.5 18087.2±2.5148.6±8.2

2.5 Box-Behnken设计优化实验

2.5.1 Box-Behnken设计实验因素 基于单因素实验结果，选择对Cur-LF-NPs制备过程中影响较大的3个因素作为考察因素，分别为反溶剂/溶剂体积比（1）、乳铁蛋白/姜黄素投料比（2）和pH值（3），每因素设置3水平，以代码值表示：−1（低水平）、0（中水平）、+1（高水平）；以包封率（1）、粒径（2）和多分散系数（polydispersity index，PDI，3）3者经CRITIC权重分析加权后的综合评分（）作为评价指标，使用Design Expert 10软件对数据进行拟合并验证优化后的工艺。因素与水平见表7。

2.5.2 CRITIC权重分析法 CRITIC法是以各评价指标间对比强度与冲突性为理论基础的客观权重赋值法，其中对比强度是指同一指标中不同方案取值的差距大小，以标准差表示，标准差越大，权重越大；冲突性又称相关性，2个指标间相关性越强则冲突性越低，权重越小。此法适合于多指标评价体系[30]。各指标权重分析前，先将星点设计实验得到的各指标数据进行归一化处理，转换为0～1的标准化数值。对于包封率来说取值越大越好，以公式包封率＝(Y－min)/(max－min)进行数据转换；对于粒径、PDI来说取值越小越好，以公式粒径/PDI＝(max－Y)/(max－min)进行数据转换。然后通过网站SPSS AU进行权重分析，结果见表8。包封率、粒径和PDI的权重系数分别为30.82%、26.37%、42.81%，加权后综合得分公式为＝(包封率×0.31＋粒径×0.26＋PDI×0.43)，实验结果见表7。

表7 Box-Behnken实验设计和结果

Table 7 Experiment and results of Box-Behnken design

序号X1X2X3Y1/%Y2/nmY3Y 116 (+1)10 (0)7 (+1)88.072.60.07882.5 28 (−1)10 (0)5 (−1)73.5186.20.19912.7 316 (+1)8 (−1)6 (0)95.379.40.06793.6 412 (0)10 (0)6 (0)90.576.60.08384.2 516 (+1)10 (0)5 (−1)93.377.60.11880.9 612 (0)12 (+1)5 (−1)91.397.80.10676.0 712 (0)10 (0)6 (0)92.780.40.08785.7 812 (0)10 (0)6 (0)91.179.40.09681.8 916 (+1)12 (+1)6 (0)94.367.60.04898.6 1012 (0)12 (+1)7 (+1)92.886.90.08485.0 1112 (0)10 (0)6 (0)92.282.50.09283.5 128 (−1)8 (−1)6 (0)80.5145.80.26218.8 138 (−1)12 (+1)6 (0)85.7121.10.16451.3 1412 (0)10 (0)6 (0)91.577.30.82085.6 1512 (0)8 (−1)5 (−1)85.5103.40.16055.7 1612 (0)8 (−1)7 (+1)87.9108.40.14261.6 178 (−1)10 (0)7 (+1)82.2150.40.25621.4

表8 CRITIC分析结果

Table 8 Results of CRITIC

指标指标对比强度指标冲突性权重/% 包封率0.2630.22430.82 粒径0.2800.18026.37 PDI0.2980.27542.81

2.5.3 Box-Behnken设计实验结果与分析 Box-Behnken设计因素及实验结果经Design Expert 10拟合后符合2次多项回归模型：＝84.18＋31.431＋10.152＋3.153－6.8812－1.7813＋0.7723－19.4012＋0.8022－15.4032，其显著性检验结果见表9。该模型的＜0.000 1（极显著），且失拟项的＝0.277 1＞0.05（不显著），证明2次多项回归模型能较好的反应综合评分（）与反溶剂/溶剂体积比（1）、乳铁蛋白/姜黄素投料比（2）和pH值（3）之间的关系。模型的变异系数为2.71，表明模型稳定；决定系数和校正决定系数分别为0.998 0、0.995 4，表明模型具有良好的拟合程度，并能解析99.54%响应面值变化情况；预测决定系数为0.979 7，表明该模型具有较好的预测性。

表9 响应面二次回归模型的方差分析

Table 9 ANOVA for response surface quadratic model

误差源平方和自由度均方F值P值 模型11 737.3191 304.15381.68＜0.000 1 X17 900.2517 900.252 312.14＜0.000 1 X2824.181824.18241.21＜0.000 1 X379.38179.3823.230.001 9 X1X2189.061189.0655.330.000 1 X1X312.60112.603.690.096 3 X2X32.4012.400.700.429 2 X121 585.0811 585.08463.90＜0.000 1 X222.6812.680.780.405 4 X32998.891998.89292.34＜0.000 1 残差23.9273.42 失拟项13.9334.641.860.277 1 净误差9.9942.50 总离差1 1761.2316

各因素交互作用的三维效应面图和二维等高线图如图2所示，其中固定1个因素，绘制另外2个因素的交互作用对综合评分的影响情况。为了得到较高的载药量，根据软件预测的最佳制备工艺为反溶剂/溶剂体积比为16∶1、乳铁蛋白/姜黄素投料比为8∶1、pH值为6，在此条件下预测的综合评分结果为93.7，合意性为0.971。

2.5.4 处方工艺的验证实验 测定最佳制备工艺条件下的3个批次的包封率、粒径和PDI，按“2.5.2”求得综合评分并与预测值相比较，计算实际值与预测值之间的偏差，结果见表10。3个批次的平均相对偏差为1.2%，可知实测值与预测值的结果相近且验证实验的重复性较好，证明了使用Box-Behnken设计-效应面法优化Cur-LF-NPs制备工艺结果可靠、重现性高。

偏差＝(实际值－预测值)/预测值

2.6 纳米粒形态观察

由图3-A可知，优化后的纳米粒制剂外观呈澄清透亮的黄色，无沉淀和不溶性微粒存在。使用TEM观察纳米粒的微观形貌，用滴管吸取少量Cur-LF-NPs并滴加于专用铜网上，使用2.0%磷钨酸钠负染色，自然挥干后观察。TEM图3-B显示纳米粒呈规则圆球状。

图2 各因素对综合评分的效应面和等高线图

表10 验证实验结果

Table 10 Results of confirmatory experiment

批次包封率/%粒径/nmPDI综合评分偏差/% 实测值预测值 195.068.50.08292.593.7−1.2 295.373.90.07094.2 0.5 396.467.40.09692.0 −1.8

图3 Cur-LF-NPs的外观 (A) 和TEM图 (B, ×50 000)

2.7 粒径、ζ电位、包封率和载药量的测定

使用NanoBrook 90 Plus PALS粒度仪对优化后的纳米粒进行粒径和电位的测定，结果见图4。平行多组实验后Cur-LF-NPs的平均粒径为（72.6±5.2）nm；多分散指数（polydispersity index，PDI）为0.084±0.015；ζ电位值为（24.5±3.7）mV。优化后的纳米粒粒径小于100 nm且分布均一，体系带正电荷，呈现良好的稳定性。

图4 Cur-LF-NPs的粒径 (A) 和ζ电位 (B) 图

按照“2.2”项下所述方法测定优化后的纳米粒的包封率与载药量，平行多组实验得出Cur-LF-NPs的包封率为（94.8±1.6）%、载药量为（10.2±0.5）%，表明其具有良好的载药能力。

2.8 稳定性试验

2.8.1 物理稳定性 作为药物递送系统，需要考察Cur-LF-NPs在各体系中的物理稳定性。取适量Cur-LF-NPs，分别加入超纯水、生理盐水、PBS缓冲液（pH 7.4、5.0）和含10% FBS的DMEM培养基稀释10倍。混匀后滴加于96孔板中，在恒温振荡器中以37 ℃、100 r/min的条件孵育24 h，以相应的溶剂作为阴性对照，每组设置3个复孔。分别于0、1、2、4、8、12、24 h用酶标仪测定各体系在685 nm波长下的吸光度（）值，结果见图5。可知24 h内各体系中的Cur-LF-NPs在685 nm波长处的值变化情况稳定，未见纳米粒团聚或崩解产生较强的光散射[31]，初步证明Cur-LF-NPs的物理稳定性良好。

图5 Cur-LF-NPs在各体系中的物理稳定性(, n = 3)

2.8.2 储存稳定性 将Cur-LF-NPs分别置于室温25 ℃（7 d）和冰箱4 ℃（30 d）条件下，记录粒径和PDI值随储存时间的变化情况，结果见表11。可知纳米粒在室温2 d内粒径、PDI几乎无变化，从第5天开始粒径和PDI的增长速率明显加快但肉眼未见纳米粒团聚现象，到第7天开始出现不溶性微粒。纳米粒在4 ℃冰箱内放置30 d内粒径和PDI较稳定。

2.9 冷冻干燥工艺考察

选择0.5%、2%、5%的甘露醇、乳糖和海藻糖作为冻干保护剂，以冻干前后粒径、PDI和ζ电位值的变化情况优选合适的冻干保护剂及用量，结果见表12。选择2%的海藻糖作为冻干保护剂，制得的冻干品复溶后的粒径、PDI和ζ电位值与冻干前的参数基本一致。冻干品外观图见图6，形为饱满圆整的饼状样，色泽均一，复溶时间短。

表11 Cur-LF-NPs在室温和4 ℃条件下的储存稳定性(, n = 3)

Table 11 Storage stability of Cur-LF-NPs at room temperature and 4 ℃(, n = 3)

t/d室温（25 ℃）t/d4 ℃ 平均粒径/nmPDI平均粒径/nmPDI 073.6±2.30.103±0.013070.2±1.50.093±0.007 182.2±5.50.076±0.025270.5±2.80.102±0.015 274.4±4.20.088±0.023476.4±5.20.094±0.019 398.8±8.70.104±0.015784.6±8.10.094±0.005 4107.4±10.60.108±0.0311294.5±1.40.099±0.010 5136.8±5.90.134±0.0351895.2±3.90.121±0.015 6152.4±10.50.164±0.0332597.5±6.20.116±0.018 7189.5±22.70.236±0.0593097.7±4.60.093±0.024

表12 冻干工艺考察(, n = 3)

Table 12 Study on freeze-drying process (, n = 3)

冻干保护剂粒径/nmPDIζ电位/mV 冻干前76.5±4.20.078±0.01022.6±1.1 无冻干保护剂95.2±1.00.090±0.0219.2±1.5 0.5%乳糖148.9±17.40.267±0.0208.1±0.9 2%乳糖191.4±10.20.264±0.01215.2±2.2 5%乳糖297.4±64.30.369±0.02610.9±1.9 0.5%甘露醇87.2±0.80.096±0.0287.3±0.7 2%甘露醇115.3±8.50.151±0.02215.8±1.4 5%甘露醇386.2±41.90.373±0.08612.1±0.6 0.5%海藻糖72.3±2.60.183±0.0169.9±1.6 2%海藻糖73.4±1.90.097±0.01521.3±0.5 5%海藻糖77.2±3.80.165±0.0246.2±0.4

图6 冻干品外观

2.10 体外释放实验

采用透析袋法考察姜黄素原料药溶液与Cur-LF-NPs的体外释放情况。各取1 mL姜黄素50% DMSO溶液与Cur-LF-NPs分别装入蒸馏水洗涤后的透析袋中，质量浓度均为300 μg/mL。随后浸入预热至37 ℃的30 mL含30%乙醇的PBS缓冲液中（pH 7.4、5.0）。恒温摇床的水浴温度为（37±1）℃，转速为100 r/min，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h完全更换等体积的释放介质，平行3组实验，用HPLC法测定透析液中姜黄素的质量浓度，按公式计算累积释放度（），结果见图7。

为释放介质体积，C为各个时间点测得的姜黄素质量浓度，为初始透析袋内药物含量

图7 姜黄素原料药和Cur-LF-NPs的体外释放曲线(, n = 3)

Fig. 7 Invitro release curves of curcumin solution and Cur-LF-NPs (, n = 3)

由图7可知，Cur-LF-NPs相较于姜黄素原料药具有一定的缓释效果；且Cur-LF-NPs在中性PBS缓冲液（pH 7.4）和酸性PBS缓冲液（pH 5.0）中的释放行为相似。通过Origin 2018软件，分别应用零级方程、一级方程和Higuchi方程对两者的体外释放行为进行拟合，结果见表13。姜黄素原料药和Cur-LF-NPs体外释放均符合一级方程，证明了2者通过扩散控制机制主导姜黄素的释放行为[32]。

3 讨论

姜黄素极难溶于水，制成纳米制剂后其抗肿瘤效果得到明显改善[33]。经实验测得其在25 ℃条件下于水中的饱和溶解度仅为（11.33±0.73）ng/mL，因此改善姜黄素在水中的分散性是促进其临床发展应用的前提。乳铁蛋白作为多功能糖蛋白[17]，既可作为配体修饰于载体上发挥靶向作用；也可充当载体递送活性药物、其本身也是活性分子具有抗微生物、抗癌和神经保护等药理作用。本实验拟设计、筛选Cur-LF-NPs的制备工艺，以期获得充分发挥乳铁蛋白脑靶向、运载和治疗活性作用的姜黄素纳米制剂，并用于后期脑部神经退行性疾病的治疗。

表13 姜黄素原料药和Cur-LF-NPs体外释放的拟合结果

Table 13 Fitting results of invitro release of curcumin solution and Cur-LF-NPs

样品拟合模型拟合结果R2 姜黄素零级方程Q＝1.96 t＋52.270.375 6 （pH 7.4）一级方程Q＝79.80(1－e−1.05 t)0.979 0 Higuchi方程Q＝12.83 t1/2＋36.760.654 3 Cur-LF-NPs零级方程Q＝2.58 t＋20.050.631 0 （pH 7.4）一级方程Q＝62.22(1－e−0.33 t)0.974 9 Higuchi方程Q＝14.86 t1/2＋6.320.896 6 Cur-LF-NPs零级方程Q＝2.59 t＋23.570.574 9 （pH 5.0）一级方程Q＝63.70(1－e−0.43 t)0.974 3 Higuchi方程Q＝15.25 t1/2＋9.160.860 7

本实验采用去溶剂化法制备Cur-LF-NPs，通过单因素考察结合Box-Behnken设计-效应面法筛选最佳制备处方工艺。优选反溶剂/溶剂体积比，利用适当的乙醇去溶剂化能使姜黄素紧密的结合于乳铁蛋白的疏水区域；优选乳铁蛋白/姜黄素投料比，以期最大程度的发挥乳铁蛋白的载体利用率从而提高纳米粒的载药量；优选pH值，为纳米粒的生成和稳定提供适宜的条件。优化后的Cur-LF-NPs粒径小于100 nm，有利于穿过紧密的脑组织间隙到达作用部位；且该纳米粒具有理想的包封率（94.8±1.6）%和载药量（10.2±0.5）%；其体外释放24 h后累积释放量达60%以上，相较于姜黄素原料药展现出一定的缓释效果。

对于体外释放研究，在前期预实验中，采取每个时间点进行取液并补液的方法，但随着纳米粒释放时间的延长，透析袋内外游离姜黄素质量浓度差越来越小，使其后的释放不能满足最佳漏槽条件。透析袋内纳米粒释放出的游离姜黄素未能及时透过透析袋而在其内形成了大量结晶，且经透析72 h后仍无法释放，累积释放量仅为（28.3±2.6）%。故正式实验时采取每个时间点完全更换释放介质的动态透析方法进行体外释放研究，这与体内不断流动、更替的体液循环相似。

储存稳定性考察中，发现Cur-LF-NPs溶液的稳定性受时间、温度等因素影响较大，且在4 ℃条件下的稳定性也仅为1个月左右，这不利于其长期储存备用。因此，拟通过将Cur-LF-NPs制备成冻干粉以延长其稳定时间。冷冻干燥技术是储存和稳定纳米粒的常用方法，但蛋白质的高级结构可能会在长时间的低温冷冻和干燥失水的情况下受到破坏。糖类作为常见的冻干保护剂，可提供羟基替代失去的水的羟基与蛋白质结合，从而稳定蛋白质原有的氢键结构，称为“水替代假说”[34]。经本实验筛选，2%的海藻糖作为冻干保护剂能较好的稳定Cur-LF-NPs的物理化学性质，冻干复溶前后未见明显的粒径、PDI和ζ电位值的变化。

综上，本实验通过Box-Behnken设计-效应面法筛选制备了一种工艺简单、绿色安全且性质稳定的Cur-LF-NPs，为后续该纳米制剂的体内脑靶向研究和相关神经退行性疾病的药效评价提供了稳定的制剂基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Optimization of curcumin-lactoferrin nanoparticles prescription process based on Box-Behnken design-response surface method andevaluation

LI Ling-hui1, 2, LIAO Wan1, 2, ZHANG Qian1, 2, YU Fang-kun1, 2, TAN Li-wei3, LI Zhang-cai3, HU Qiong-dan1, 2, ZHANG Xin-jie1, 2, LIAO Yang-yang1, 2, HOU Shu-guang1, 2, 3, LI Rui1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Sichuan Purity Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 610041, China

To optimize prescription process of curcumin lactoferrin nanoparticles (Cur-LF-NPs) by Box-Behnken design-response surface method.Cur-LF-NPs were prepared by the desolvation method. Based on the results of single factor experiment, the anti-solvent/solvent volume ratio, lactoferrin/curcumin weight ratio and pH value were selected as the investigational factors for the subsequent Box-Behnken design optimization experiment. The comprehensive score of entrapment efficiency, particle size and polydispersity coefficient obtained by CRITIC weight analysis and calculation were chosen as the evaluation parameters, and simulated and verified by Design Expert 10 software. Finally, the physical property of Cur-LF-NPs, including the morphology, particle size, potential, drug loading capacity, stability andrelease behavior were characterized and evaluated.The optimized prescription process were obtained as follows: the volume ratio of anti-solvent/ solvent was 16:1, the weight ratio of lactoferrin / curcumin was 8:1 and the pH value was 6. The particle size of Cur-LF NPs was (72.6 ± 5.2) nm, the PDI was 0.084 ± 0.015, and the ζ potential was (24.5 ± 3.7) mV; The entrapment efficiency was (94.8 ± 1.6)%, and the drug loading was (10.2 ± 0.5)%. Compared with free curcumin, therelease of Cur-LF-NPs has a certain sustained-release effect.The process for the preparation of Cur-LF-NPs was optimized by the Box-Behnken design-response surface screening method, the Cur-LF-NPs showed uniform particle size, good drug loading capacity and acceptable stability. This study provided a solid preparation basis for futureandresearch of Cur-LF-NPs.

curcumin; lactoferrin nanoparticles; Box-Behnken design-response surface method; CRITIC weight analysis; prescription process screening

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 5980 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.005

2022-04-25

国家自然科学基金面上项目（82073994）；四川省科技计划重点研发项目（2020YFN0152）；四川省科技厅科技项目（2020JDJQ0049）；农业部杂粮加工重点实验室开放课题（2019CC02）；成都中医药大学杏林学者学科人才科研提升计划（QJJJ2021002）

李岭慧，女，硕士研究生，从事中药新制剂、新剂型和新技术研究。E-mail: 1354776917@qq.com

侯曙光，男，博士，首席教授，博士生导师，从事创新型药物递送及药剂学研究。E-mail: shuguang.hou@scpurity.com

李 锐，男，博士，教授，硕士生导师，从事中药的化学分析、质量控制及体内代谢研究。E-mail: lirui@cdutcm.edu.cn

#共同第一作者：廖 婉，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事新制剂、新剂型及中药炮制工艺与机制研究。E-mail: liaowan@cdutcm.edu.cn

[责任编辑 郑礼胜]