丛枝菌根真菌减少污染土壤Cd淋溶流失的效应研究

张金秀，苏琳，蒋明，李明锐，王灿，何永美，陈建军，湛方栋*

（1.云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201；2.昆明市生态环境科学研究院，昆明 650032；3.中国冶金地质总局昆明地质勘查院，昆明 650203）

由于金属矿产开采冶炼、污水灌溉和污泥施用等工农业生产活动，农田土壤重金属污染日益严重，成为全球重大环境问题之一。镉（Cd）是农田土壤常见的污染元素，具有较强的活性与迁移能力，易随水体淋溶流失。在灌溉、降雨等情形下，污染农田土壤Cd离子发生淋溶流失，迁移到周边水体中，进而导致流域水体Cd污染。因此，污染土壤的Cd淋溶流失问题引起了普遍关注。

丛枝 菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中重要的微生物，即使在重金属严重污染的土壤中，AMF也普遍存在。AMF侵染寄主植物根系后，根外菌丝在土壤中分枝延伸形成庞大的菌丝网络，其生态学作用引起人们的广泛关注。AMF菌丝在土壤中能迅速分解转化，显著改变土壤结构和理化性质，对土壤Cd等元素的环境行为与生态效应产生重大影响。然而，这方面的研究主要集中在AMF增强植物对Cd的耐受性、影响Cd在土壤-植物系统中迁移上，但对AMF影响污染土壤Cd的淋溶流失及其作用机制的了解很有限。

土壤团聚体组成会显著影响污染土壤Cd的淋溶流失。其中，大团聚体是由微团聚体黏合而成的一类比表面积大、多孔的土壤团粒结构，其黏附力远大于环绕在周围的微小团粒。大团聚体对土壤养分和水分具有较好的固持作用，且对Cd离子具有较强的吸附作用，有助于减少污染土壤Cd的淋溶流失。值得注意的是，AMF能够通过菌丝缠绕、分泌球囊霉素相关蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP）等作用促进土壤团聚体的形成。因此，AMF可能会通过影响污染土壤的团粒组成，改变土壤Cd的淋溶流失，这为研究AMF影响污染土壤Cd淋溶流失的可能机制提供了思路。

本文以云南典型的铅锌矿区周边Cd污染农田土壤为供试基质，制备高度为40 cm的土柱，以玉米为寄主植物，设置接种和不接种AMF处理，开展土壤淋溶试验，研究AMF对玉米生长、Cd吸收、土壤团粒组成、壤中流Cd浓度与Cd淋溶流失的影响，分析土壤团粒组成与壤中流Cd浓度、Cd淋溶流失间的关系，以阐释AMF影响污染土壤Cd淋溶流失的效应及其初步机制，丰富对污染土壤中AMF的生态功能及其作用机制等方面的认识。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试玉米（L）为会单4号，购于云南省昆明市小板桥种子市场，所选种子籽粒饱满且大小一致。AMF供试菌种为摩西斗管囊霉（），其菌种保藏号为BGC YN05，1511C0001BGCAM0013，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供，主要由土壤颗粒、孢子和细根段组成。

供试土壤采自云南省兰坪铅锌矿（26°22'30.0″N，99°22'27.6″E）周边污染农田，其基本理化性质如下：pH为6.11，有机质为32.12 g·kg，Cd和Pb全量分别为4.27 mg·kg和68.29 mg·kg，全氮和全磷含量分别为2.87 g·kg和1.58 g·kg，碱解氮和速效磷含量分别为72.54 mg·kg和58.03 mg·kg。土壤采回后，经自然风干，剔除杂物，捣碎研磨后过2 mm尼龙筛混匀，将土壤放入蒸汽高压灭菌锅，121℃高温灭菌120 min后，常温条件放置3 d待用。

1.2 试验处理

2018年6 月，在云南农业大学试验大棚内开始土柱试验。试验土柱为直径110 mm、高45 cm的聚氯乙烯（PVC）管；采用灭菌土壤装填土柱，每个土柱土壤装填量为4.0 kg（图1）。土柱底端封闭，设置1个出水阀，用于收集淋溶液；在土柱的10、20 cm和30 cm深度处设置壤中流取样点，用于采集壤中流样品。

图1 试验装置与取样位置示意图Figure 1 Schematic diagram of test device

玉米种子首先在1%次氯酸钠（NaClO）溶液中浸泡1 min，然后移入75%的乙醇溶液中浸泡3 min，取出后用无菌水冲洗3次，完成玉米种子的表面消毒。将玉米种子置于垫有浸湿滤纸的无菌培养皿中，25℃下恒温培养4 d，待种子萌发冒白2 cm左右，挑选无污染且生长一致的萌发种子进行种植。

试验设不接种AMF（CK）和接种AMF（AMF）2组处理，每组处理6个平行。先在土柱中装入3.5 kg灭菌土，AMF处理将40 g AMF菌剂平铺在土柱中，CK处理则加入40 g AMF灭活菌剂；种植2粒玉米种子，再均匀加入500 g灭菌土，以覆盖玉米种子（图1）。土柱试验过程中不施用化肥和农药，自然光照，温室温度为14～29℃；期间根据土柱土壤水分状况浇灌去离子水20～30 mL，保持土壤湿润。

1.3 样品采集

在玉米种植第45天和第50天，进行人工灌溉，开展淋溶试验。每次灌溉量为2.0 L，每15 min浇灌去离子水500 mL，共浇灌4次，相当于33.3 mL·min的降雨强度。

在浇灌开始后，打开土柱底部的出水阀，收集土柱产生的淋溶液，直至出水阀不产生水滴，使用容量筒测量淋溶液体积。浇灌30 min后，采用0.25µm陶瓷滤管（RHIZON MOM 19.21.21F）负压抽取深度为10、20 cm和30 cm的土柱土壤溶液50 mL。

第2次土柱淋溶试验后，采集玉米植株与根际土壤样品。将玉米整株取出，抖去根部附着的疏松土壤，采集与根系紧密结合的根际土壤（厚度约为1 mm），室内自然风干、研磨后备用。将玉米植株分为地上部（茎叶）和地下部（根系），分别用无菌水漂洗干净、晾干；除选取少量细根用于AMF侵染率指标测定外，玉米植株于105℃杀青30 min，再经75℃烘干72 h至恒质量，获得植株干质量，碾磨粉碎备用。

1.4 测定方法

将根系鲜样剪成1 cm左右的根段，碱解离、蓝墨水染色后，采用曲利苯蓝染色改良法测定AMF的侵染率。采用蔗糖离心法测定AMF孢子数：称取10.0 g土样，反复冲洗过0.25 mm筛，将残留物转移至100 mL的离心管中，3 000 r·min离心10 min，去掉上清液后加入50%蔗糖溶液，充分摇匀，3 000 r·min离心10 min得到上清液，用滤纸过滤上清液，在立体显微镜下观察滤纸上AMF孢子的数量。

称取1.0 g风干土样，在0.11 MPa、121℃条件下，采用20 mmol·L柠檬酸缓冲液（pH 7.0）提取30 min，得到易提取球囊霉素相关蛋白（Easy extractive glomalin related soil protein，EE-GRSP）的待测液；50 mmol·L柠檬酸钠缓冲液（pH 8.0）提取60 min，连续提取3次，得到总球囊霉素相关蛋白（Total glomalin related soil protein，T-GRSP）的待测液。采用Braford法测定土壤EE-GRSP和T-GRSP的含量。

称取过2 mm筛的风干土样30 g，放置于土壤团粒分析仪中，套筛孔径依次为0.85、0.25 mm和0.075 mm，采用湿筛法分离不同粒径的土壤团聚体，于105℃下烘至恒质量，分别称量，获得粒径（）＞0.85、0.25～0.85、0.075～0.25 mm和＜0.075 mm的土壤团聚体含量。

称取1.0 g土样，采用0.1 mol·LHCl浸提-火焰原子分光光度法测定土壤有效态Cd的含量。称取0.5 g植株干样，采用HSO-HO消解-凯氏定氮法-钒钼黄比色法测定植株全氮和全磷的含量。称取0.1 g植株干样，采用HNO-HClO消解-火焰原子吸收分光光度法测定植株的Cd含量。

吸取10 mL壤中流或20 mL淋溶液，采用HNO-HO消解，石墨炉原子吸收法测定溶液的Cd浓度。将淋溶液Cd浓度乘以其体积，获得土柱Cd的淋溶流失量。

1.5 统计分析

采用Microsoft Excel 2018对数据进行处理，用SPSS 23.0软件进行数据统计分析；用LSD法检验处理间差异显著性，＜0.05为显著，＜0.01为极显著；采用Person法分析相关性，用OriginPro 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 玉米根系AMF侵染特征

AMF在玉米根系中的结构见图2。经检测，接种AMF土壤的根系侵染率为25%，菌丝密度为28.36 cm·g，孢子数为18.82个·g。

图2 AMF在玉米根系中的结构Figure 2 Typical structures of AMF in maize roots

由图3可知，与CK相比，AMF处理0～10 cm和10～20 cm土层土壤EE-GRSP含量显著上升，分别增加24%和33%，0～10、10～20、20～30 cm和30～40 cm土层土壤T-GRSP含量分别显著增加44%、36%、16%和11%。综上可知，重金属胁迫下接种AMF能不同程度增加0～40 cm不同土层土壤中EE-GRSP和TGRSP的含量。

图3 接种AMF对土壤球囊霉素相关蛋白含量的影响Figure 3 Effects of AMF on contents of GRSP in soil

2.2 接种AMF对土壤团聚体粒径分布的影响

由图4可知，与CK相比，AMF处理0～10、10～20 cm和30～40 cm土层土壤中＞0.85 mm团聚体含量分别显著增加28%、46%和13%，0～10、20～30 cm和30～40 cm土层土壤中0.85 mm＞＞0.25 mm团聚体含量分别显著增加10%、22%和55%。而与CK相比，AMF处理0～40 cm土层土壤中0.25 mm＞＞0.075 mm团聚体含量均显著降低，降幅为10%～12%，0～10 cm和10～20 cm土层土壤中＜0.075 mm团聚体含量分别显著降低13%和16%。综上可知，重金属胁迫下土壤接种AMF能增加土壤＞0.25 mm团聚体含量，降低＜0.25 mm团聚体含量。

图4 接种AMF对不同土层土壤不同粒径团聚体含量的影响Figure 4 Effects of AMF on aggregate contents in soil

2.3 接种AMF对土壤有效态Cd含量和植物Cd吸收量的影响

由图5可知，与CK相比，AMF处理0～10、10～20 cm和30～40 cm土层土壤中有效态Cd含量分别显著降低26%、16%和27%，表明接种AMF能不同程度降低土壤不同土层的有效态Cd含量。

图5 接种AMF对不同土层土壤有效态Cd含量的影响Figure 5 Effects of AMF on available Cd contents in soil

由表1可知，与CK相比，AMF处理玉米地上部生物量显著增加36%，地上部和地下部Cd含量分别显著降低45%和40%，地上部和地下部Cd吸收量分别显著降低25%和31%。

表1 接种AMF对玉米Cd含量和累积量的影响Table 1 Effects of AMF inoculation on biomass，Cd content and accumulation in maize

2.4 接种AMF对壤中流Cd含量的影响

由图6可知，与CK相比，第一次淋溶试验后，AMF处理0～10 cm和20～30 cm土层的壤中流Cd含量显著降低20%和23%，第二次淋溶试验后，AMF处理10～20 cm和20～30 cm土层的壤中流Cd含量显著降低22%和14%。表明重金属污染胁迫下土壤接种AMF能减少不同土层壤中流的Cd含量。

图6 接种AMF对壤中流Cd含量的影响Figure 6 Effects of AMF on Cd concentrations in interflow

2.5 接种AMF对Cd淋溶流失的影响

由表2可知，与CK相比，第一次淋溶试验后，AMF处理对淋溶液Cd含量和Cd流失量均没有显著影响；第二次淋溶试验后，AMF处理下淋溶液Cd含量和Cd流失量分别显著降低30%和34%；第二次淋溶试验后，AMF处理下淋溶流失总量降低29%。表明接种AMF能减少淋溶液中有效态Cd含量与流失量。

表2 接种AMF对土壤Cd含量和流失量的影响Table 2 Effects of AMF inoculation on Cd content and loss in soil

2.6 相关性分析

由表3可知，＞0.85 mm的团聚体含量与壤中流Cd含量呈显著负相关；0.85 mm＞＞0.25 mm的团聚体含量与T-GRSP呈显著正相关，与壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量呈极显著负相关；0.25 mm＞＞0.075 mm的团聚体含量与Cd淋溶流失量呈显著正相关；＜0.075 mm的团聚体含量与T-GRSP和EE-GRSP含量呈显著负相关，与Cd淋溶流失量呈显著正相关。土壤有效态Cd含量与壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量分别呈极显著与显著正相关。

表3 GRSP、淋溶液Cd含量、Cd流失量与土壤水稳态团聚体、有效态Cd含量的相关性Table 3 Correlations between contents of available Cd and GRSP，Cd concentration in interflow and leachate with contents of aggregate and available Cd in soil

3 讨论

在重金属胁迫下，与CK相比，接种AMF土壤的T-GRSP和EE-GRSP含量显著增加，土壤有效态Cd含量显著降低。GRSP是AMF代谢分泌的一类糖蛋白，能与土壤中重金属结合，改变重金属的生物有效性，GRSP含有的芳香烃、羟基等不稳定活性官能团，能够通过离子交换吸附-配合-共沉淀作用，促使土壤中的重金属由离子态向残渣态转变。有研究表明，GRSP能固定土壤中Cd、Pb等重金属离子，且GRSP与土壤有效态Cd、Pb含量呈负相关，其结果与本试验研究结果一致。

本试验中，在重金属胁迫下，接种AMF后，0～40 cm土层的＞0.25 mm团聚体含量显著高于CK。AMF侵染寄主植物后形成的发达的根外菌丝与其分泌物GRSP的机械缠绕，联合腐植酸类物质的超强黏合作用将土壤颗粒缠绕黏合形成土壤团聚体。菌丝、GRSP以及腐植酸在团聚体稳定性中扮演着重要的角色，其能将小土壤颗粒黏成＜0.25 mm的微团聚体，进而形成水稳态团聚体（＞0.25 mm）。有学者研究不同真菌对土壤结构的影响发现，土壤接种AMF后稳定性团聚体含量远高于微团聚体含量；有学者研究接种不同真菌对水稳性大团聚体形成的作用得出，接种真菌的土壤形成水稳性大团聚体的含量显著高于未接种土壤。但目前对于团聚体的形成因素中，AMF根外菌丝、GRSP以及腐植酸类物质哪种因素占主导地位或者为主要因素还未有准确结果，还需进一步验证。

本研究结果表明，与CK相比，接种AMF后，0～40 cm土层的＞0.25 mm团聚体含量显著增加，0～40 cm土层土壤有效态Cd含量显著下降。这可能是由于不同粒径团聚体对土壤中重金属吸附固定作用有明显的差异，此外，不同粒径土壤团聚体中AMF菌丝、GRSP以及腐植酸类物质含量不同以及团聚体结构也存在差异。接种AMF能改善土壤团聚体的水稳定性，吸附固定土壤有效态重金属。团聚体是农田土壤中重金属吸持的关键因素，0.2～2 mm粒径的团聚体能够集聚大量的植物根系以及腐植酸类物质等，对重金属有很强的吸附固持能力。

土壤中游离态Cd离子极易在土壤中迁移流动，在灌溉、降雨、降雪等淋溶作用下，Cd离子下渗到地下水，或扩散到流域出水口，影响地下水水质，扩大农田土壤Cd污染面积。降低Cd的移动性，将Cd固定在土壤中以减少Cd的流失量是解决Cd流失的关键性因素。GRSP是菌根共生体分泌物，含有大量土壤有机质、多环芳烃以及阴离子基团，其特殊的组成结构能改变土壤中有效态重金属的生物有效性，将游离态金属离子转变为残渣态金属沉淀物。大量相关研究表明，重金属胁迫下，接种AMF后能降低土壤环境中重金属的生物有效性，其分泌的GRSP能够固定土壤中的Cd；当土壤中Cd含量较高时，GRSP对Cd的固定量也较高。本研究结果表明，重金属污染胁迫下，接种AMF土壤的GRSP浓度显著上升，不同土层土壤有效态Cd含量显著降低。

不同粒径的土壤团聚体对土壤中Cd吸收率和淋溶流失的影响存在差异。＞0.25 mm的水稳性团聚体具有多孔性、比表面积大等特性，且富含大量的腐植酸类物质，能够增加对Cd离子的吸附-络合-螯合等作用，从而改变重金属Cd在土壤中的存在形态，将游离态Cd固定在土壤中，减少Cd的淋溶流失。有研究表明，＞0.25 mm的水稳态团聚体吸附有效态重金属的效率显著高于＜0.25 mm的微团聚体，能使淋溶液中的有效态重金属含量降低，重金属流失量减少。本研究结果显示，0～40 cm土层水稳态团聚体含量显著增加，两次淋溶0～30 cm土层壤中流有效态Cd含量显著降低，第二次淋溶的淋溶液中有效态Cd含量和流失量均显著降低，且Cd淋溶流失量与＞0.25的团聚体含量呈显著负相关，与＜0.25 mm的团聚体含量和土壤有效态Cd含量呈显著正相关。综上可知，重金属污染胁迫下，接种AMF能增加土壤水稳态团聚体含量，降低淋溶液中有效态Cd浓度和流失量。

4 结论

（1）重金属污染胁迫下，接种丛枝菌根真菌能够降低土壤中有效态Cd含量，从而减少土壤有效态Cd在玉米体内的富集，缓解重金属对植物的毒害，促进植物生长。

（2）接种丛枝菌根真菌能够强化土壤对壤中流Cd的固持效应，降低壤中流有效态Cd浓度，从而减少灌溉等淋溶作用下土壤Cd的流失量和扩散效应。