大豆和豌豆分离蛋白复合热促凝胶特性的研究

王可尧，任仙娥，杨锋，黄永春，张昆明，刘纯友，黄承都

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006)

大豆分离蛋白(soybean protein isolate，SPI)营养价值高且不含胆固醇，因其具有良好的理化性质和加工特性而被充分应用于食品工业中[1-3]。豌豆分离蛋白(pea protein isolate，PPI)生物价高，富含促进人体肌肉增长的赖氨酸和可以提鲜调味的谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸[4]，其亚基组成和SPI相似，且不含过敏原，但因PPI功能性较SPI差，且SPI在植物蛋白中优势较多，其在食品领域中利用率低[5]，因此考虑在PPI中添加有较好功能特性的SPI，制备出一种低脂、低胆固醇和高营养价值的SPI和PPI复合热促凝胶。热促凝胶的形成大致分为三步:首先,在一定强度的热处理后，蛋白分子间共价键或次级键遭到破坏，亚基逐渐去折叠，功能基团暴露；其次,蛋白分子间彼此靠近，通过分子间相互作用发生聚集；最后,聚集的蛋白相互交联形成凝胶网络结构[6]。

SPI和PPI作为植物蛋白中应用最为广泛的两种蛋白质，将两者共混应用于植物基食品的开发中有利于提高食品的总营养价值，为消费者提供健康新选择。本文以植物混合蛋白凝胶为模型研究不同蛋白浓度和不同比例下(11%、14%、17%)复合SPI和PPI热促凝胶特性，利用流变仪模拟凝胶形成的全过程，利用质构仪测定其成胶强度，通过凝胶的持水率结果来判断凝胶网络结构的优良程度。研究在17%浓度下复合热促凝胶的分子间作用力大小和类型，探索凝胶结构性质差异的原因，最后利用扫描电子显微镜来观察其微观结构差异，从而为设计植物基食品的结构和功能提供理论指导，为开发新类型不同种类植物基食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(蛋白含量≥90%)：山东禹王生态实业有限公司；豌豆分离蛋白(蛋白含量≥80%)：烟台双塔食品股份有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

MCR 72旋转流变仪 奥地利Anton Paar有限公司；TA-XT Plus质构分析仪 英国Stable Micro System公司；JXN-26高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特股份有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司；LGJ-10D台式冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；Phenom ProX扫描电子显微镜 上海复纳科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 复合凝胶流变学分析

配制蛋白浓度分别为11%、14%、17%，蛋白质比例(SPI和PPI的比例)分别为1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的SPI和PPI混合蛋白溶液，使用2 mol/L HCl或NaOH溶液调节pH至8.0，磁力搅拌2 h，使其充分溶解。

采用旋转流变仪模拟凝胶形成全过程。选用PP50平行板(直径50 mm；间隙值1 mm)，上样后刮除多余液体，在转子四周滴加硅油以防止温度过高使水分蒸发。整个过程中温度扫描参数为：1 Hz和应变0.5%，以2 ℃/min的速度从25 ℃升高至95 ℃，然后在95 ℃下保温30 min，再以2 ℃/min的速度降温至25 ℃，记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)随时间和温度的变化情况[7]。

1.3.2 复合热促凝胶的制备

将上述配制好的混合蛋白溶液分装至玻璃瓶中，封上盖子，于恒温水浴锅中95 ℃热处理30 min，冰水浴冷却到室温后，于4 ℃过夜保存，测试前需于室温下放置30 min。

1.3.3 复合凝胶强度的测定

利用TA-XT Plus质构分析仪对制得的凝胶样品进行凝胶强度测定。条件设定为：探头类型P/0.5；测试前速度5.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s和测试后速度5.0 mm/s；触发力为3 g。探头下压至10 mm时出现的最大的力定义为凝胶强度。

1.3.4 复合凝胶持水率的测定

称取约5 g复合凝胶样品装入10 mL离心管中，以转速10000 r/min离心10 min，用滤纸小心吸出离心后样品沥出的水分，称取重量，持水率计算公式为：

式中：W1为样品质量(g)，A为蛋白浓度，W2为样品沥出水分后的质量(g)。

1.3.5 复合凝胶分子间作用力的测定

参照Tanger等[8]的测定方法，并稍作调整。用大蒜压榨器将蛋白浓度为17%的复合凝胶样品压碎，分别称取0.5 g样品于三角烧瓶中，加入20 mL S1(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.5)，置于恒温摇床中振荡1 h使其充分溶解，于10000 r/min离心15 min得上清液；取沉淀加入20 mL S2(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液+2 g/L SDS，pH 7.5)振荡、离心后得上清液；再取沉淀加入20 mL S3(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液+2 g/L SDS+15 g/L二硫苏糖醇，pH 7.5)振荡、离心后得上清液，向上述各步离心后所得上清液中加入20 mL 20 g/dL的三氯乙酸，离心取沉淀加入1 mol NaOH溶解，离心得上清液，采用福林酚比色法测定其可溶性蛋白质含量。溶解于S1的蛋白质含量代表静电作用的贡献，溶解于S2的蛋白质含量代表疏水相互作用的贡献，溶解于S3的蛋白质含量代表二硫键的贡献。

1.3.6 凝胶微观结构的观察

将17%的复合凝胶样品冷冻干燥后取小块颗粒，使用导电双面胶将其固定在样品台上，通过离子溅射喷金处理，喷金时间为20 s。喷金结束后，将样品台放入扫描电子显微镜后对凝胶微观形态结构进行观察记录。测试条件为加速电压10 kV，放大倍数300倍。

1.3.7 数据分析

文中实验数据均重复3组，每组至少3个平行。通过SPSS 22.0软件Duncan检验法进行显著性分析，P<0.05表示差异显著，实验结果以平均数±标准差的形式表示，图片通过Origin 8.0软件制作。

2 结果与分析

2.1 复合凝胶流变学性质

储能模量G′代表固体性质，与凝胶弹性有关；损耗模量G″代表液体性质，与凝胶黏性相关[9]。11%、14%和17%浓度下不同蛋白比例的SPI和PPI复合蛋白热促凝胶形成曲线随时间和温度的变化情况见图1。

图1 SPI与PPI复合凝胶流变学

由图1可知，在升温-保温-降温的热循环过程中，复合蛋白的G′和G″变化趋势基本一致。

在11%、14%和17%浓度下，SPI和PPI的比例为1∶0和3∶1时，以及在14%和17%浓度下，SPI和PPI的比例为1∶1时，复合凝胶的G′值始终大于G″值，且在升温过程中，G′和G″表现为先下降后上升的趋势，此过程包括凝胶形成、凝胶消弱和凝胶提高3个阶段[10]。由于SPI黏度大，一开始G′值就大于G″值，表现出固体性质。随着温度的升高，蛋白质与蛋白质之间和蛋白质与水之间的氢键断裂，体系的黏度下降，因此，G′值和G″值随温度的增加反而不断下降。PPI的变性温度大约在75～85 ℃，而SPI的变性温度在85～95 ℃，在保温阶段，95 ℃已达到SPI和PPI完全失活温度，复合蛋白的高级结构被破坏，蛋白质内部的疏水性基团、巯基、二硫键等基团暴露，蛋白分子间交联聚集转变为更加有序的凝胶网络结构，G′值和G″值持续增加。在降温阶段，随着温度的下降，凝胶结构G′值和G″值持续增加，凝胶网络结构进一步稳固。

在11%浓度下，SPI和PPI蛋白比例为1∶1时，在14%浓度下，蛋白比例为1∶3时，以及在17%浓度下，蛋白比例为1∶3和0∶1时，体系初始的G′小于G″，这可能是因为随着豌豆蛋白比例的增加，体系的黏度降低。随着温度的升高，G′增加的速度大于G″，G′和G″出现交点，标志着三维网络开始建立，此时的温度和时间被称为成胶温度和成胶时间。随后，G′开始大于G″，蛋白分子间发生聚集交联，模量增加，凝胶网络结构不断加强，在该阶段二硫键促进分子间重排，形成稳固的凝胶结构。在降温阶段，凝胶网络结构主要由氢键来维持，较低温度下有利于氢键的形成，G′和G″持续增加。

在11%浓度下，当SPI和PPI蛋白比例为1∶3和0∶1时，以及在14%浓度下，蛋白比例为0∶1时，G″值一直处于大于G′值的状态，凝胶未形成，此时的浓度未达到形成凝胶的浓度。在不同浓度下，随着蛋白浓度的增加，同一比例下最终形成凝胶的储能模量值不断增加。在不同的比例下，随着PPI的增加，最终形成凝胶的储能模量值不断下降，这可能是由于PPI稀释了有较强SPI凝胶的G′值，说明SPI凝胶样品相比PPI凝胶具有较高的类固体性质，因此可通过调控不同的SPI和PPI浓度及比例，降低PPI的成胶浓度。

2.2 复合凝胶强度的测定

分析不同蛋白浓度下SPI和PPI以不同比例混合形成的复合热促凝胶强度，结果见表1。

表1 SPI 与PPI复合热促凝胶强度(g)

由表1可知，随着蛋白浓度的增加，凝胶强度显著升高(P<0.05)；同一浓度下，随着PPI比例的增加，凝胶强度显著下降(P<0.05)。蛋白浓度是热促凝胶形成的决定性因素之一[11]，蛋白浓度越高，凝胶强度越大，其原因主要是随着蛋白浓度的增加，热诱导可暴露更多的活性基团数目，提高了蛋白分子间交联聚集的机会，因此形成了更致密的凝胶网络结构，凝胶强度也随之增大[12]，这与流变最终的储能模量测定结果一致。对于SPI，仅通过热处理方式自发形成凝胶的蛋白临界浓度为8%，而对于PPI，形成凝胶所需的最低蛋白浓度为16%[13]，当低于最低成胶蛋白浓度时，蛋白样品仅靠加热的方式无法形成凝胶。因此，当蛋白浓度为11%、SPI和PPI蛋白比例为1∶3和0∶1时，以及蛋白浓度为14%、SPI和PPI蛋白比例为0∶1时，复合蛋白不能通过热处理自发成胶。当复合蛋白浓度为17%时，均能形成热不可逆的凝胶样品。此外，在不同比例下，由于PPI含硫氨基酸含量较SPI少[14]，SPI对复合体系凝胶强度起主要作用，随着PPI添加量的增大，稀释了有较强凝胶特性的SPI，凝胶强度不断降低。

2.3 复合凝胶持水率分析

持水率是指蛋白凝胶网络有效固定水分子的能力强弱，是反映凝胶网络优良的重要指标[15]。不同蛋白比例和蛋白浓度下复合热促凝胶的持水率见表2。

表2 SPI与PPI复合热促凝胶持水率(%)

由表2可知，随着蛋白浓度的增加，凝胶持水率变化趋势与储能模量、凝胶强度结果一致，说明蛋白浓度的增加使蛋白分子间交联密切，有利于形成致密的凝胶网络结构，而凝胶网络结构越致密、有序，持水率越高。单一SPI凝胶在11%、14%和17%浓度下和复合SPI和PPI在蛋白浓度为14%和17%、蛋白比例为3∶1时，持水率均接近100%，说明在高浓度下SPI和少量添加PPI形成的凝胶结构十分致密，在高速离心力作用下不受破坏，几乎没有水分渗出。随着PPI比例的持续增加，复合凝胶持水率显著降低(P<0.05)。一方面可能是由于PPI的溶解度低于SPI[16]，PPI在形成凝胶网络时不易更好地结合水分子，因此持水率下降。另一方面，PPI比SPI含硫氨基酸含量少，形成的凝胶强度低，因此凝胶结构持水率低于SPI。

2.4 复合凝胶形成的分子间作用力分析

形成和维持蛋白质热促凝胶的主要作用力包括静电作用、疏水相互作用等非共价键和二硫共价键[17]，分子间作用力的大小、类型不同凝胶结构性质也会有所差异[18]。通过添加不同的变性剂，采用逐步溶解的方法，测得上清液中蛋白质的溶解性大小，可间接反映维持凝胶稳定的静电作用、疏水相互作用和二硫键大小[19]。17%蛋白浓度下复合凝胶形成的分子间作用力结果见图2。

图2 SPI与PPI复合凝胶分子间作用力

由图2可知，静电作用随着PPI蛋白比例的增高而显著升高(P<0.05)；疏水相互作用先升高后降低，在SPI和PPI的比例为1∶3时达到最大；二硫键显著降低(P<0.05)。在热诱导中，二硫键是维持SPI凝胶网络结构的主要作用力，静电作用和疏水相互作用对维持PPI凝胶网络贡献较大，因此SPI形成的凝胶结构较PPI更为稳固。静电作用随着PPI含量的增加不断增大，在pH 8.0实验条件下，pH远离SPI和PPI蛋白等电点，蛋白质表面带有大量的净负电荷，此时静电斥力占主导，蛋白质间难以聚集成胶，当静电斥力与吸引力主要是疏水相互作用达到平衡时，才有可能形成凝胶网络结构，而当引力大于斥力时，形成高度脱水收缩的不透明凝胶结构。在热处理过程中，蛋白质分子结构打开，疏水基团暴露，疏水相互作用增强，随着PPI比例的增加，疏水相互作用显著增高(P<0.05)，可能是由于PPI中疏水性氨基酸的含量高于SPI[20]，但单一PPI蛋白凝胶疏水相互作用略有降低，可能是由于95 ℃远高于PPI的变性温度，蛋白聚集程度增高，一部分的疏水基团因聚集作用重新被包埋在蛋白分子内，导致疏水相互作用有所降低。二硫键是形成蛋白凝胶网络结构的主要作用力，二硫键随着PPI含量的增加不断降低，可能是由于PPI含硫氨基酸含量小于SPI，此结果导致PPI凝胶储能模量、硬度和持水率均小于SPI。

2.5 复合凝胶的微观结构

利用扫描电子显微镜对17%蛋白浓度下凝胶微观结构进行分析，结果见图3。

图3 SPI与PPI复合凝胶微观结构

由图3可知，不同比例下凝胶的微观结构有较大的差异。SPI凝胶表面质密、孔洞均匀，蛋白质分子间从各个角度进行交联，相互交织，形成稳固的结构。当SPI和PPI的比例为3∶1时，凝胶孔径变大，说明少量PPI的加入导致SPI凝胶网络结构变差。当SPI和PPI的比例为1∶0和3∶1时，凝胶微观结构立体感更强，可能导致凝胶强度、持水率更好。随着PPI组分的增加，凝胶结构越趋于片层状，形成不规则的断层，使总体结构显得粗糙。分析不同比例下凝胶微观结构差异的原因，可能是随着PPI比例的增加，维持凝胶分子间作用力的不同，主要是二硫键含量的减少，导致凝胶质地变差。

3 结果与讨论

本文以SPI和PPI为原料，通过对11%、14%和17%浓度下复合热促凝胶特性的研究发现，蛋白浓度越高，储能模量、凝胶强度和持水率越高。同时，两种植物蛋白的凝胶性差异较大，随着PPI比例的增加，复合蛋白最终形成凝胶的储能模量、凝胶强度和持水率呈不断下降的趋势，形成的凝胶网络结构质地越来越松散、零碎，蛋白间交联度减弱，凝胶性能逐渐变差。分析复合热促凝胶分子间作用力发现疏水相互作用和二硫键对SPI凝胶贡献较大，静电作用和疏水相互作用对PPI凝胶贡献较大，分子间作用力的类型不同暗示着SPI和PPI凝胶性能不尽相同，因此通过在PPI中添加SPI可提高PPI的凝胶特性，提高PPI在食品工业中的利用率，同时也为不同植物基蛋白产品的复配研究提供了理论依据。