GC-MS分析四川不同产地花椒的代谢成分

花椒是芸香科植物花椒和青椒的干燥果实[1]，原产于我国，主要分布于四川省、陕西省、云南省、山西省等多省市地区[2-3]。其种植历史悠久，种质资源丰富，在栽培驯化过程中形成了诸多栽培品种（品系），尤以西南地区最多[4-5]。花椒气味清香、麻味浓郁，挥发性成分（如香气成分）是花椒的关键品质指标，已有报道显示，青花椒和红花椒的香气成分有一定的差异，芳樟醇、柠檬烯为青花椒的主要挥发成分，芳樟醇、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯为红花椒的主要挥发性成分[6]。乙酸芳樟酯和α-松油醇是区分不同产地青花椒的潜在化合物[7]；乙酸芳樟酯和乙酸松油酯是区分不同产地红花椒的潜在化合物[8]，而柠檬烯、乙酸松油酯等为南方4产区红花椒的主要共有挥发成分，在不同产区花椒中含量差异较大[9]。目前对不同产地、不同品种花椒的品质研究愈发关注，本文收集了产自四川各地的13种花椒样品，应用气相色谱-质谱联用仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）非靶向检测技术对花椒样本的代谢成分进行检测分析，实现对四川产地的不同花椒品种在代谢成分上进行并集分析和相对含量的差异比较，以期为不同花椒的选择及评价提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

赛默飞ISQ 7000单四极杆气质联用仪GC-MS系统；赛默飞Trace 1300_1310气相色谱仪；Agilent J &W Scientific公司的DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；离心机（湖南湘仪离心机有限公司）；水浴锅（上海力辰仪器科技有限公司）；涡旋振荡仪（上海力辰仪器科技有限公司）；旋转蒸发浓缩仪（湖南赫西仪器装备有限公司）。

1.2 试剂

甲醇和BSTFA，默克化工技术（上海）有限公司；吡啶、甲氧胺和核糖醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 供试材料

本研究所有组别共13种花椒，其分组、名称和来源等信息如表1所示。

表1 供试材料信息表

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理

将材料研磨成粉末后，取适量样本加入0.8 mL 80%甲醇溶液和5 μL内标（核糖醇，5 mg·mL-1），涡 旋1 min，4 ℃超 声30 min，12 000 r·min-1离 心10 min；取200 μL于1.5 mL离心管中，旋转蒸发浓缩和冻干后，加入35 μL的20 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液，强烈振荡30 s，于37 ℃下反应90 min；取出后加入35 μL BSTFA（含1%TMCS）进行衍生，于70 ℃下反应60 min；反应完室温静置30 min，进行GC-MS代谢组学检测。

1.4.2 GC-MS色谱与质谱的条件

仪器参数设定：进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，高纯氦气（纯度大于99.999%）作为载气，分流比为10∶1，进样量1.0 μL，溶剂延迟5 min。升温程序：初始温度70 ℃，10 ℃·min-1的速度升至200 ℃，然后以5 ℃·min-1的速度升至280 ℃，并维持10 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为30～550（m/z）。

1.5 数据分析

本数据在Thermo数据软件Chromeleon7.0下对GC-MS数据进行特征峰提取，并根据NIST 17数据库对数据进行整理，在Excel 2016软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包含Retention time（保留时间）、观察量（材料样本）和峰强等信息。为研究不同组内和组间的共有成分和独有成分，使用韦恩图进行组分集合分析。默认采用的分析数据选取SI＞700物质。每个分组作为一个集合，进行组内与组间的分析。相对含量采用内标标准化法进行计算，将代谢成分对应的峰面积除以内标物质核糖醇的峰面积而得到一个相对含量值。

2 结果与分析

2.1 成分分析

3组样品中的代谢产物成分可分为糖、有机酸、烷类、醇类、烯类和酯类等，包含有多种挥发性的香气成分和消炎类功效成分。参考相关报道，花椒与青花椒中挥发性香气成分相对含量高的有乙酸芳樟酯、芳樟醇、柠檬烯。对13个样本里3种物质的相对含量进行比较，结果如表2所示。青花椒组中乙酸芳樟酯的相对含量明显低于其他11种花椒，而芳樟醇含量高于11种花椒。

表2 乙酸芳樟酯、芳樟醇、柠檬烯的相对含量表

对3个分组进行成分的并集分析，显示川产花椒、品种花椒、青花椒这3组花椒共有成分有12种，如图1所示。其中熊果苷、奎宁酸、桃叶珊瑚苷是消炎抗氧化功效成分，此外还有常见脂肪酸-棕榈酸、酰胺类成分-花生四烯酰胺。目前花椒中以上成分的研究较少，未有研究显示其是花椒的麻味成分。

图1 3组花椒共有成分图

2.2 各组共有成分分析

对3组花椒的共有成分进行分析，如图1所示，川产花椒组和青花椒组的共有成分数量较多，品种花椒组的成分完全被青花椒组涵盖，不存在品种花椒组独有成分；青花椒组和川产花椒组的共有成分有5种，青花椒组和品种花椒组的共有成分有2种；青花椒组独有成分有36种，川产花椒组独有成分有7种。青花椒组独有成分是最多的，这可能与藤椒和九叶青花椒的独特风味有关。品种花椒组和青花椒组的共有成分，包含有原儿茶酸和10-十一酸，其中原儿茶酸成分具有一定的消炎功效[10]。

川产花椒组和青花椒组的共有成分有5种，见表3，其共有成分中的大根香叶烯D在六月椒、七月椒和汉源花椒中也有检出，推测其不是某一类花椒的特有香气成分；此外共有成分中还有儿茶素和蜜二糖这两种消炎功效的成分，其中蜀椒2号、蜀椒4号和藤椒中检出儿茶素的相对含量较高。

表3 川产花椒组与青花椒组共有成分的相对含量表

2.3 各组独有成分分析

品种花椒组的成分均被川产花椒组和青花椒组涵盖，不存在品种花椒组独有成分。川产花椒组有7种独有成分，其中香气成分有β-桉叶油醇和法尼醇。β-桉叶油醇是一种樟脑香型成分，具有抑菌、消炎及增进食欲的功效[11-12]；法尼醇是一种花香型的香气成分，具有一定的抑菌消炎功效[13]。但这两种成分在青花椒组中均未检出，可能这两种成分与川产花椒组的香味及特征等存在一定的关系。

青花椒组有36种独有成分，其中香气成分有蛇麻烯、癸醛、D-柠檬烯、β-石竹烯、α-松油醇、异胡薄荷醇、橙花叔醇和香芹醇，这些香气成分除在青花椒组中存在外，还在川产花椒及品种花椒组中的一些花椒品种中存在（表4）。虽然其中各成分在13种花椒中分布存在，没有特殊成分，但只有青花椒组是8种香气成分全部检出的组别，推测这些香气成分的组成差异性与青花椒独特风味的香型相关。

表4 青花椒组中香气成分的相对含量与分布表

青花椒组独有成分中包含有消炎成分莽草酸、紫杉叶素。莽草酸通过影响花椒共有成分花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，具有抗炎、镇痛作用[14]。青花椒组独有成分还包括多种氨基酸成分，如4-氨基丁酸、L-脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸和L-丝氨酸。青花椒组在氨基酸种类上明显多于其他种类花椒。其中异亮氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸仅在青花椒组中存在，是青花椒组的特殊成分。

2.4 其他成分

个别样本独有成分包括香叶醇、L-苏氨酸、反式-β-罗勒烯、L-谷氨酰胺、L-色氨酸、油酸酰胺、十六碳酰胺、γ-依兰油烯和己酰胺。

3 结论与讨论

各花椒品种中的乙酸芳樟酯相对含量均高于青花椒组，推测乙酸芳樟酯是红花椒类品种香型构成的主要物质。川产花椒组和除汉源花椒的其他花椒里都检出了β-桉叶油醇和法尼醇，相对含量上，川产花椒组整体高于品种花椒组，青花椒组未检出这两种成分，推测β-桉叶油醇和法尼醇可能是花椒属间的差异物质。芳樟醇在青花椒组的相对含量明显高于各花椒品种，其中藤椒的相对含量值最高。青花椒组是蛇麻烯、癸醛、右旋柠檬烯、β-石竹烯、松油醇、异胡薄荷醇、橙花叔醇和香芹醇共8种香气成分都检出的组别，推测这些香气成分与花椒相比的组成差异性，与构成青花椒独特风味的香型相关。

13个样本中均检出熊果苷、奎宁酸、桃叶珊瑚苷，这些物质具有消炎抗氧化的功效，推测是花椒类植物的功效性成分。儿茶素也是一种消炎功效型成分，在蜀椒2号、蜀椒4号和藤椒中检出儿茶素的相对含量较高。品种花椒组和青花椒组的共有成分原儿茶酸具有抑菌功能。莽草酸和紫杉叶素在多数样本中被检出，其中莽草酸通过影响花椒共有成分花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，紫杉叶素是天然抗自由基抗氧化的黄酮类化合物。

青花椒组在氨基酸种类上明显多于其他种类花椒，其中异亮氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸仅在青花椒组中存在，是青花椒组的特殊成分，也可能是花椒属间的差异物质。推测氨基酸相对含量和种类组成与青花椒的呈味表现相关，是构成青花椒独特风味的相关成分。