苜蓿青贮乳酸菌的筛选及应用研究进展

韩宇杰 房 义 钟荣珍* 向 海

(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所，吉林省草地畜牧重点实验室，长春130102；2.中国科学院大学，现代农业科学学院，北京100049)

苜蓿是一种具有较高营养价值的传统豆科饲料作物，它耐旱、耐寒、耐盐碱、耐贫瘠，粗蛋白质含量高，茎叶柔嫩鲜美，各种营养成分齐全，含有丰富的氨基酸和维生素，而且是仅有的含有维生素B12的植物性饲料[1]，一直被用作反刍动物饲料。近年来，在反刍动物产业可持续发展的背景下，苜蓿的种植面积在世界范围内不断增加。青贮是一种以厌氧微生物为基础的发酵过程，主要由乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)产生乳酸(lactic acid，LA)，以降低青贮过程中的pH并抑制有害微生物增殖。青贮作为一种保存湿润牧草的有效方法，可以最大限度保持苜蓿青绿饲料的营养特性。长期以来，它一直是一种常用的饲料保存方法[4]，经过青贮可减少苜蓿营养物质的损失，使其变得容易消化，并提高适口性[5]。本文归纳和阐述了苜蓿青贮乳酸菌的筛选及其应用情况，以期为发掘适合紫花苜蓿青贮的乳酸菌提供科学依据。

1 苜蓿青贮方法

由于苜蓿的季节性收获，需要对其进行加工然后保存，以应对冬季牲畜饲料的短缺。苜蓿饲草加工方式多样，如干草、青贮等[2]。苜蓿调制干草受不良气候或机械等因素的影响，造成可消化蛋白质损失30%[3]。与其他粗饲料相比，苜蓿具有高缓冲能力(BC)和缺乏水溶性碳水化合物(WSCs)的特性，导致其青贮发酵进程慢，稳定性差，而较难获得优质的苜蓿青贮[6]。已有研究表明，在一定的管理条件下，采用一些化学或生物添加剂对高水分苜蓿原料进行处理，例如使用半干青贮和添加剂青贮等方法，是克服这些缺陷的一种实用方法[7]。

1.1 半干青贮

半干青贮也称低水分青贮，是待原料水分含量降低后再进行青贮，这种方法的关键在于控制青贮原料的含水量。如果苜蓿青贮时原料水分含量过高，经过梭状芽孢杆菌发酵的青贮原料伴随着密集的丁酸产生和蛋白质水解，极易发生丁酸发酵，导致青贮饲料发臭，品质下降，利用效率大大减少[8]。目前关于低水分苜蓿原料含水量多少才可以保持苜蓿青贮最佳营养成分的研究没有明确指标，但含水量一般在40%～65%区间内[9-11]，这样不仅降低了植物细胞氧化作用，还避免了养分流失。

半干青贮是较为单一的苜蓿青贮方式，单纯控制原料含水量提升青贮品质的能力有限，现在苜蓿青贮技术已经进入一个新的时期，即添加剂青贮。

1.2 添加剂青贮

添加剂青贮是在青贮原料中添加1种或多种物质，从而对发酵起促进或抑制作用的青贮方式。青贮饲料发酵质量在很大程度上取决于青贮原料中的微生物群落组成[12]。青贮添加剂使用历史悠久，种类繁多，根据其作用效果可分为5种：第1种为发酵促进剂[乳酸菌制剂、酶制剂、绿汁发酵液(PFJ)、糖类等]，作用为促进乳酸产生，降低pH，有利于青贮饲料保鲜贮存；第2种为发酵抑制剂(酸类、甲醛等)，作用为抑制青贮过程中不良微生物的繁殖，防止饲料腐败霉变，减少发酵过程中的营养成分流失；第3种为有氧腐败抑制剂(乙酸、丙酸、山梨酸、苯甲酸等)，通过直接抑制酵母和霉菌的繁殖来提高青贮饲料的有氧稳定性；第4种为营养性添加剂(尿素和氨)，用于提高青贮饲料的营养价值及适口性；第5种为吸收剂(麦麸、稻草等)，通过吸收青贮原料中水分，减少渗出液的产生和干物质损失。其中，发酵促进剂是近几年来研究的热点，而其中应用于生产较多的是乳酸菌制剂[13]。

2 适合苜蓿青贮的乳酸菌的筛选

乳酸菌呈棒状(杆菌)或球形(球菌)，它在厌氧条件下可以利用水溶性碳水化合物产生乳酸，其特点是对酸度的耐受性强，这有助于其在自然发酵中的增殖胜过其他细菌，目前已广泛应用于发酵食品、饮料以及饲料的生产过程中。在苜蓿青贮初期，明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)等球菌生长旺盛，促进乳酸发酵，后期则以乳杆菌属(Lactobacillus)增殖为主[14]。

青贮所用乳酸菌按照其发酵途径不同被分为同型发酵乳酸菌、兼性异型发酵乳酸菌和专性异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌应用比较广泛，其糖酵解产物只有乳酸；兼性异型发酵乳酸菌和专性异型发酵乳酸菌还会产生乳酸以外的产物。相对于其他发酵产品，接种同型发酵或兼性异型发酵乳酸菌可以迅速降低pH和增加乳酸产量，用于青贮的主要菌种有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)[18]。专性异型发酵乳酸菌包括布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)等，它们可以同时产生乳酸和乙酸，虽然与同型发酵乳酸菌相比其产酸速度较慢，但可以在有氧阶段抑制有害菌的生长，提高青贮饲料的有氧稳定性，抑制二次发酵的产生[19]。

将乳酸菌应用于苜蓿青贮，已成为快速降低苜蓿青贮过程中的pH、减少营养物质和干物质损失的一种常见做法。乳酸菌不仅具有“公认的安全”的地位[15]，还具有许多其他优点，如对健康有益、易于处理、成本低、能耗低、产量高。乳酸菌对青贮饲料加工技术和质量做出了较大的贡献，如改善风味、感官结构和最终产品的保存时间[16]。苜蓿自身附着的乳酸菌数量少，而要保证青贮过程中乳酸菌占主导地位，在青贮过程中引入外源乳酸菌便显得十分重要[17]。

影响苜蓿青贮过程中乳酸菌发酵的因素通常包含内在和外在2个方面。内在因素即乳酸菌本身的因素，包括：1)乳酸菌的种类和数量；2)乳酸菌的活性及繁殖能力；3)乳酸菌的产酸和耐酸能力；4)乳酸菌的糖原利用能力。外在因素即苜蓿原料的特性如含水量、缓冲能和含糖量等[20]。要综合内外2个方面的因素来筛选适合苜蓿青贮的乳酸菌添加剂。

Fitzsimons等[21]在1992年发表了关于选择菌株作为青贮饲料潜在接种剂的第1项研究。在这项研究中，研究人员从一些草料中分离出18株片球菌属的菌株，并为这些草料选择接种剂。最初通过实验室测试对菌株进行评估，包括评估生长、产酸能力、蛋白质或乳酸分解以及在不同pH和温度下生长的能力，发现乳酸片球菌G24最适合作为青贮接种剂。该试验结果表明了筛选的重要性，因为属于同一物种的菌株之间也存在差异。普通的乳酸菌有时并不能改善苜蓿青贮的品质，这可能与苜蓿饲料作物本身的特性有关。例如，苜蓿缺乏足够的水溶性碳水化合物，导致青贮过程中乳酸菌产酸较少[22]，这也导致在青贮过程中发酵程度较低。此外，成功地将乳酸菌应用于苜蓿青贮的一个必要因素就是苜蓿与所使用微生物之间的相容性[23]，在大多数研究中，接种剂都是从苜蓿青贮自身中分离出来的。因为从将被接种的栖息地分离出来的本地菌株可以提供竞争优势，青贮接种菌的功效是基于它们与牧草中附生微生物群的有效竞争能力。在苜蓿青贮条件下，适合的乳酸菌一般具有以下几个特点：1)产酸能力和活性强；2)可以提高饲料的有氧稳定性；3)耐胁迫能力强；4)抑菌能力较好[24]。迄今为止，很少有报道用于确定适合苜蓿青贮条件的乳酸菌菌株的筛选方法。Carvalho等[25]总结了一套青贮饲料潜在微生物菌剂的选择标准，其主要过程如图1所示，可以用于苜蓿青贮乳酸菌的筛选。Zhao等[26]研究出一种针对苜蓿青贮条件所设计的乳酸菌筛选方法，以苜蓿粉作为培养基有效筛选了在苜蓿青贮中具有潜在应用价值的乳酸菌植物乳杆菌ZZU203。李荣荣等[27]以抑菌活性、酸化苜蓿汁液能力及生理生化等为指标，从苜蓿自身附生的乳酸菌中筛选出了植物乳杆菌LP31，其对产气荚膜梭菌和酪丁酸梭菌的抑菌活性高并且酸化苜蓿汁液能力强。由此可以看出，植物乳杆菌是一类适合苜蓿青贮的乳酸菌。如果微生物接种剂不适合该发酵过程，它会降低青贮饲料的品质。例如，在甘蔗青贮饲料中接种植物乳杆菌则导致干物质损失增加和乙醇浓度增加[28-29]。

图1 青贮饲料潜在微生物菌剂的选择标准

除了自然筛选和诱变筛选所获得的乳酸菌菌株，也有研究者通过转基因技术将真菌中具有特殊功能的基因转移至乳酸菌中表达，从而得到具有特定功能的乳酸菌工程菌株。例如，Liu等[30]将里氏木霉(Trichodermareesei)的纤维素酶基因(bgl1、cbh2、egl3)转移至乳酸乳球菌中，应用后发现，与纤维素酶和野生乳酸乳球菌亚种组合处理的青贮相比，转基因乳酸乳球菌菌株可以有效地发酵高水分的苜蓿青贮，苜蓿青贮表现为较低的pH和氨态氮含量，不含丁酸，品质更高，且转基因乳酸乳球菌菌株对提高木质纤维素转化为糖的效果优于纤维素酶和野生型乳酸乳球菌亚种的组合。

3 乳酸菌在苜蓿青贮中的应用

3.1 乳酸菌单独添加和混合添加

早期研究者发现使用传统的纯乳酸菌剂作为苜蓿青贮的起始剂，可以确保青贮早期快速发酵，并最大限度地减少营养物质和干物质的损失[31]。然而，使用这种类型的接种剂可能会导致苜蓿青贮的有氧稳定性下降，因为传统乳酸菌剂所产生的短链脂肪酸不足，而短链脂肪酸能够抑制酵母和霉菌的生长[32]。接种异型发酵乳酸菌布氏乳杆菌可以解决短链脂肪酸不足的问题，其能在厌氧环境下将适量的乳酸转化为乙酸和1,2-丙二醇，已被证明可以改善苜蓿青贮的有氧稳定性，并且可以通过抑制路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)的丰度来提升苜蓿青贮的粗蛋白质含量[33]。1,2-丙二醇也是一种重要的乳酸菌代谢物，Schmidt等[34]发现其在苜蓿青贮过程中对提高青贮饲料的有氧稳定性有重要作用。除布氏乳杆菌外，希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)也具有此种功能(产生乙酸和1,2-丙二醇)[35]，但目前将希氏乳杆菌用于苜蓿青贮的研究较少。

青贮饲料中经常存在真菌毒素，真菌毒素是有害的，动物食用它们后可能致癌、致畸和致命，并造成重大的经济损失。被多种真菌毒素污染的苜蓿青贮饲料可能对家畜产生交互影响，因此必须对其进行降解或转化。有些乳酸菌在发酵过程中可以通过与毒素结合来降低其在青贮饲料中的浓度，如戊糖片球菌[36]。Jiang等[36]以戊糖片球菌为菌种制作苜蓿青贮饲料，采用高通量测序方法检测青贮过程和有氧恶化过程中的微生物群落的动态变化，以解释戊糖片球菌对青贮过程的影响，结果显示，接种戊糖片球菌的苜蓿青贮发酵品质有所提高，戊糖片球菌在发酵前期可迅速产酸，降低pH，从而改善苜蓿青贮的发酵环境，并有效抑制红曲霉的增殖，但其对有氧稳定性的改善效果不显著。因此，生产中常以戊糖片球菌作为青贮的启动菌。Schmidt等[37]则发现苜蓿青贮中布氏乳杆菌种群无法主导青贮早期的发酵过程，因为其生长比较缓慢，并且布氏乳杆菌需要在厌氧条件下生长至少7周之后才可以改善青贮的有氧稳定性；而同时添加戊糖片球菌和布氏乳杆菌会使苜蓿青贮的早期阶段发酵速度更快，同时提高发酵质量和有氧稳定性。

在饲料青贮研究中，植物乳杆菌是最常用的细菌培养剂。苜蓿春夏收获期多雨、青贮过程时温度高的情况普遍存在于中国中东部和南方等气候特征相似的地区。在苜蓿青贮条件如此恶劣的情况下，接种植物乳杆菌显著促进了pH下降、乳酸积累和乳酸杆菌的增殖；并且，接种植物乳杆菌后梭状芽胞杆菌的生长受到抑制，进一步延缓了青贮饲料的腐败变质[37]。王小芬等[38]通过连续限制性培养从苜蓿青贮饲料中筛选出包含4种乳杆菌(植物乳杆菌、韩国泡菜乳杆菌、香肠乳杆菌、戊糖乳杆菌)的乳酸菌复合系Al2，将其加入苜蓿青贮中，可使苜蓿青贮pH和氨态氮含量下降，乳酸含量升高，显著提高青贮品质，并且发现植物乳杆菌起着主导作用。除了改善青贮品质，植物乳杆菌还可以在瘤胃中存活并发挥益生菌的作用[39]。一些研究人员将益生菌效应的机制归因于乳酸菌接种剂改善了青贮发酵过程中真蛋白质的保存，进而改变了瘤胃发酵。然而，乳酸菌影响瘤胃中生化变化的机制尚不清楚。

在大多数苜蓿青贮的研究中，乳酸菌菌株组合的效果是积极的。然而，研究人员并没有解释这种协同效应的原因。为了加强对乳酸菌的理解，今后有必要从遗传学上分析哪些基因在2种乳酸菌共孵育期间是活跃的。

3.2 乳酸菌与纤维素酶混合添加

青贮时纤维素酶和半纤维素酶等纤维分解酶的应用对苜蓿这类低碳水化合物牧草最为有利[40]。纤维分解酶通过将结构性碳水化合物降解为可用于乳酸菌利用的水溶性碳水化合物，从而提高青贮过程中的乳酸产量，加速pH下降。另外，纤维分解酶还可以分解植物细胞壁，提高青贮饲料的消化率。Hristov等[41]报道，提高青贮饲料的品质和消化率是降低甲烷(CH4)排放强度最有效的缓解策略之一。然而，也有研究表明，纤维分解酶的使用对苜蓿青贮饲料的消化率没有影响或产生了负面影响，原因可能是高水分的苜蓿含有少量水溶性碳水化合物，一些纤维素酶不能降解苜蓿的木质纤维素，或者纤维素酶的一些木质纤维素降解产物不能被乳酸菌发酵[42-43]。Chen等[8]研究发现，单独使用纤维素分解酶会导致更多的异型发酵并降低高水分苜蓿青贮的营养价值，乳酸菌单独使用或者与纤维素分解酶混合使用对高水分苜蓿青贮的营养价值有积极影响。使用乳酸菌可以改善高水分苜蓿青贮饲料瘤胃发酵与青贮期间真蛋白质的保存，并刺激瘤胃功能微生物(普氏菌属)的生长。Chen等[8]与魏晓斌等[44]的研究结果相同，两者研究结果都表明纤维素分解酶与乳酸菌的联合使用效果好于两者单独使用。

3.3 乳酸菌与其他菌种或化学物质混合添加

有研究表明柠檬酸和苹果酸可以加速乳酸菌的生长[45-46]。然而，与接种植物乳杆菌的苜蓿青贮相比，进一步使用苹果酸和柠檬酸并没有促进乳酸发酵，且苹果酸+植物乳杆菌处理的苜蓿青贮的乳酸浓度甚至更低，但是苹果酸或柠檬酸+植物乳杆菌处理对降低苜蓿青贮饲料中的非蛋白氮(nonprotein nitrogen)很有效[47]。

彭海兰[48]研究发现，葡萄糖与乳酸菌混合添加对苜蓿青贮品质的改善效果要比单独添加乳酸菌好。杨玉玺等[49]发现，苜蓿青贮原料含水量不同，会导致乳酸菌混合添加剂处理的青贮效果不同，苜蓿原料含水量与乳酸菌混合添加剂有互作效应。含水量为50%左右时，选择植物乳杆菌与纤维素酶混合添加青贮效果最佳；含水量为60%左右时，选择植物乳杆菌与蔗糖混合添加青贮效果最佳；含水量在70%左右时，选择植物乳杆菌与蔗糖混合添加青贮效果最佳。

芽孢杆菌是一种新型青贮接种剂。Lara等[50]发现该菌属的一些菌种可以通过产生抑制酵母和霉菌的细菌素来提高青贮饲料的有氧稳定性，这些菌种在动物饲粮中的应用也对饲料利用率和动物生长性能产生了积极影响。还有研究发现许多芽孢杆菌(如蜡状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)是青贮发酵过程中植物结构性碳水化合物降解过程中微生物酶的主要来源[51]，然而关于芽孢杆菌接种剂对苜蓿青贮发酵特性影响的研究目前较少。Li等[52]用产纤维素酶芽孢杆菌单独处理苜蓿青贮，发现其并没有明显改善青贮品质，原因可能是其在青贮环境下生存能力低。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)可以产生淀粉酶、复合纤维素酶等物质，可以将多糖分解为单糖为乳酸菌的生长提供碳源。Bai等[53]发现接种枯草芽孢杆菌可以促进苜蓿青贮发酵，改善有氧稳定性，并降低蛋白质水解和干物质损失。而枯草芽孢杆菌与布氏乳杆菌的组合则限制了彼此的作用，但也通过增加乳酸和乙酸的浓度而有利于发酵。刘欢欢[13]对比了单独添加植物乳杆菌和混合添加植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌对苜蓿青贮的影响，发现前者使霉菌数量极显著升高，后者使霉菌数量极显著降低，丙酸含量显著升高，说明植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌混合添加有效抑制了有氧腐败，比单独添加植物乳杆菌效果好。

单宁酸是天然植物多酚类化合物，有研究表明单宁酸能够抑制青贮过程中蛋白质的降解和杂菌生长，调控青贮发酵品质[54]。在苜蓿青贮过程中，单宁酸与植物乳杆菌配合使用可以减弱单宁酸单独使用时对青贮饲料干物质降解的抑制作用[55]。

4 小结与展望

目前关于青贮过程中乳酸菌的发酵原理、作用特点以及影响因素已十分明确，但对于乳酸菌在青贮中的开发和利用还处于起步阶段，可运用于苜蓿青贮的乳酸菌更是少之又少。

针对存在的问题，可以从“量和质”2个方面加强对苜蓿青贮乳酸菌的研究与利用。“量”的方面，可以通过对我国不同生态环境中的乳酸菌资源进行充分发掘，并对其进行筛选，保存适宜苜蓿青贮的优良乳酸菌菌株，丰富乳酸菌种质资源库；“质”的方面，提高苜蓿青贮乳酸菌筛选技术，找到一种短时间内能够快速有效提高苜蓿青贮饲料有氧稳定性的异型发酵菌株或者既能以乳酸发酵为主又能抗青贮有氧腐败的同型发酵菌株，这将会有十分重要的意义。筛选出的乳酸菌菌株还必须具有适合工业栽培的特性，并在贮藏期间保持稳定。单一品系乳酸菌很少具有提高青贮品质所需的所有理想特性，因此需加强对乳酸菌混合添加剂的研究，找寻更多菌株组合的可能，利用其互相之间的优势来弥补存在的短板，使苜蓿青贮饲料的品质更上一层楼。