初发类风湿关节炎患者肠道微生物群落的基因组学特征分析

马晓莉,郝春芳,郭东更,吴丽丽,张明珠,杨亚珊，陈坤婷，张英强，徐天宇，殷 喆，郭江涛

类风湿关节炎(RA)是一种结缔组织病，属于免疫性疾病(AID)，其主要病理特征为关节炎症、滑膜炎，并且伴有机体内多系统的免疫炎症反应[1]。研究表明，肠道微生物的功能变化和构成与自身免疫性疾病存在紧密联系，可能与RA疾病密切相关，其机理是肠道微生物及其代谢产物通过对机体免疫功能进行调节，进而影响自身免疫病的发生发展[2]。人体内环境的稳态维持离不开宿主免疫系统同微生物群之间的相互作用[3]。本研究借助高通量测序技术探究初发RA患者和健康人群体内肠道菌群的组成特点与差异，深入分析RA的肠道菌群特征，从而为RA的预防与治疗提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选择2020年8月至2021年10月宁夏回族自治区人民医院住院的30例初发类风湿关节炎患者为RA组(RA组)，男9例，女21例，年龄28～71岁，平均年龄(52±10)岁。随机选择同期健康体检人员30名为健康对照组(HC组)，男10例，女20例；年龄21～65岁，平均年龄(45±15)岁。2组年龄、性别等方面对比差异无统计学意义 (P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断、排除标准：(1)与美国风湿病学会和欧洲风湿病防治联合会2010年确立的RA诊断标准相符[4]。(2)排除条件：①患有严重的心、肾、内分泌、消化、血液系统疾病者；②患有结缔组织病(CTD)、干燥综合征(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎(AS)等自身免疫病或影响免疫功能的其他疾病者。③既往接受过抗风湿治疗的患者；④曾使用激素治疗的患者；⑤近3个月内使用过抗生素的患者；⑥曾接受胃肠动力药治疗的患者；⑦有胃肠炎病史的患者。

1.3 方法

1.3.1 肠道微生物群落的基因组学研究

1.3.1.1 粪便样本的采集：按标准采集流程使用配套的粪便套装收集患者清晨中间段新鲜粪便标本约200 mg，常温保持运输，3日内进行检验。

1.3.1.2 总DNA提取：采用QUBIT RNA HSAssay Kit、QUBIT dsDNA HS Kit试剂盒及QIAsymphony SP 核酸自动提取仪、Qubit 3.0核酸定量仪提取粪便细菌基因组总DNA，严格按照说明书进行实验操作。

1.3.1.3 基因组测序：应用ION TORRENT平台技术、Ion PGM基因组测序仪对细菌16 S rDNA V2、V3、V4、V6、V7、V8、V9可变区进行靶向高通量测序并构建文库。按照样品准备、扩增16S高变区及纯化、测定文库浓度、末端修复及纯化、连接接头及纯化、扩增文库及纯化、测定文库浓度顺序进行，对筛选所得有效序列开展除杂，获得优化序列。

1.3.1.4 菌群多样性分析：借助Shannon指数等完成稀释曲线，对2组实验对象的复杂度进行分析，结果显示所测数据量完整，能够反映样本所有微生物的多样性信息。最后对实验数据进行OTU分析、Alpha样品多样性分析、LEfSe样本组间差异性分析。

1.4 统计学方法：采用qiime2(version 2022.2)进行Alpha多样性分析(Chao1、Goods_coverage、Observed_species、Shannon、Simpson等物种多样性统计)，并使用biobakery LEFSe对效应量测量(LEfSe)后展开计算。相对丰度箱线图绘制后使用软件R(version 4.2.0)进行操作，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组肠道菌群基因组测序OTU分析:初发RA组的肠道菌群丰度低于对照组，肠道菌群OUT总量上较对照组偏低，见图1(封二)。在既定相似度下聚类获得各样品OUT数量，绘制Venn图，2组合计75个OTU；RA组、HC组特有OTU个数分别为32个和4个，见图2(封二)。

2.2 2组肠道菌群基因组测序Alpha分析:菌群多样性比较显示，2组多样性指数分析中Chao1指数、Observe_species指数、Simpson指数、Goods_coverage指数方面差异无统计学意义(P>0.05)，2组之间Shannon指数比较差异有统计学意义(P<0.05)，RA组低于HC组，见表1。

表1 2组Alpha diversity指数差异性分析

2.3 2组肠道菌群基因组测序LEfSe样本分析:菌群结构和菌群差异分析得出，2组在门、科、属水平上差异具有统计学意义(P<0.05)，初发RA患者组放线菌门(Actinobacteria)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、厚壁菌科(Clostridiales Family XIII Incertae Sedis)相对丰度与健康对照组相比较明显增加(P<0.05)。初发RA患者组木假单胞菌属(Paraprevotella)、Tyzzerella属、类杆菌属(Coprobacter)相对丰度与健康对照组相比则明显减少(P<0.05),见图3-图4(封二)。

3 讨论

肠道所含微生物种类超过了1000种，对300万以上的细菌基因(微生物组)进行编码，其数量为人类基因数量的150倍[5]。目前包括高通量测序在内的各项基因测序技术的提高使得研究者对人体微生物的构成和作用能够进行更深入的分析。研究者不再局限于对肠道菌群能够调节机体营养代谢、抵抗病原体、维持肠道黏膜屏障完整等作用的研究，而更加重视其在维持宿主免疫应答反应。肠道菌群发生紊乱会致病菌的数量异常提高，可导致肠道黏膜屏障的完整性受损、炎性细胞聚集、分泌趋化因子等多种促炎因子，帮助T细胞迁移并激活外周B细胞，使其分化为成熟的浆细胞产生大量自身抗体作用于关节滑膜，最终导致了免疫相关性关节炎的发生[6]。

类风湿关节炎是较为多见的自身免疫病之一，其主要机制与环境因素、免疫系统、遗传因素之间相互作用相关。有研究表明，肠道菌群失调与多种自身免疫性疾病与代谢性疾病存在联系，如干燥综合征(SS)[7]、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎(AS)、糖尿病(DM)、动脉硬化性脑梗死[8]等。16SrDNA可揭示生物物种的特征核酸序列，成为分析细菌的系统发育及分类鉴定的最佳指标。本次试验的样本测序深度具合理性，丰度分布曲线表明各样本的菌群丰富度及均匀度皆较好，经由coverage 指数可知，此项试验中的样本菌群对于多数菌种具备良好覆盖率。经测序发现，RA病人肠道菌群多样性、丰富度均低于健康人群，这与国内外多项研究结果一致。提示RA病人体内存在肠道菌群紊乱。有研究证明，肠道菌群多样性降低，肠道内环境之间平衡被破坏，会导致黏膜免疫功能异常，可成为多种自身免疫性疾病的重要诱因[2]。

人体肠道微生物的构成为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门与拟杆菌门4大类。其中拟杆菌门及厚壁菌门相对丰度达90%以上，变形菌以及放线菌等其他菌相对丰度则在10%以下，此类肠道菌群结构对于肠道稳态的维持发挥着重要作用。肠道菌群失调会导致免疫系统疾病发生[9]。此项实验借助软件LEfSe开展线性判断分析(LDA)得出：①门上对比结果显示：RA组粪便中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度明显增加，与谭迪等学者的研究结果一致。已有研究报道称放线菌门(Actinobacteria)在 RA、多发性硬化症(MS)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)等自身免疫病患者中数量明显增多[10]，说明此类细菌可能在自身免疫炎症过程中发挥了重要作用，甚至直接参与其中。②科上比较得出，RA患者厚壁菌科相对丰度显著升高,同有关研究结果一致。厚壁菌门的梭菌属于一种革兰氏阳性厌氧菌，对人体营养物质代谢发挥着关键性作用。梭菌可经由发酵饮食所含的可溶性纤维产生短链脂肪酸(SCFA)以促进维生素的合成。动物模型试验结果显示，口服SCFAs可以提高Treg细胞含量，使得淋巴细胞介导的自身免疫疾病病情得到改善[11]。另有报道结果显示，口服SCFAs对于Treg、Th1以及Th17这3类细胞的发育有促进作用，使得子宫炎与肾脏炎症变得更加严重[12]。也有试验结果显示，喂食SCFAs的小鼠，可经由加强K/Bx N血清转移诱导AIA，导致K/Bx N小鼠患多发性关节炎，表现为类似于RA的软骨、骨的破坏。转移K/Bx N小鼠血清能够在大多数小鼠品系中诱导关节炎[13]。科上比较得出，RA患者双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)相对丰度显著升高。Bifidobacteriaceae可单独诱导Th17细胞，并且在小鼠模型中促进自身免疫性关节炎，而动物双歧杆菌和长双歧杆菌则可诱导IFN-γ和TNF-α，促进炎症反应[14]。③属上比较得出RA组类杆菌属(Coprobacter)、木假单胞菌属(Paraprevotella)，Tyzzerella属相对丰度低于健康对照组。有实验结果显示，从共生型脆弱拟杆菌中引入细菌多糖对这些自身免疫性疾病的发展具有抑制作用[15]。

总之，初发RA病人肠道菌群丰度较健康者明显偏低，一些菌群有着明显区别，本研究中的部分结果与既往研究不相符，考虑可能是因为肠道菌群易受病情、年龄、饮食、地理位置等多种因素影响[13]。肠道菌群变化和RA的病理机制存在确切联系，但尚未探明其确切机制，需要通过更为深入的研究来明确。对肠道菌群紊乱进行靶向治疗，可能为探索RA的治疗方案带来新的研究方向。早期改善肠道菌群失调，恢复肠道菌群稳态有望降低RA的发病并减轻病情活动程度、延缓疾病进展，成为传统治疗方法的补充。