非热加工消减水产品致敏性及其评价方法的研究进展

钟航宇，王满生 ，郑键欣，成军虎,3,

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640；2.中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙 410205；3.华南理工大学现代食品工程研究中心，广东广州 510640）

水产品大多富含优质蛋白质和不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，在人们日常膳食中占据着重要地位。水产品中的鱼类和甲壳类具有较高的致敏性，都属于联合国粮农组织（FAO）公布的八大类过敏原之一。2020 年，全国水产品总产量6549.02 万吨，人均占有量46.39 kg，水产品过敏人群超过1000 万，但是目前绝大多数水产品加工企业并未对水产品中的过敏原做特殊处理，为保障消费者的饮食安全，利用食品加工技术消减水产品致敏性已成为研究重点。

食品加工技术可分为热加工和非热加工，虽然热处理对部分水产品过敏原可以起到较好的致敏性消减作用，但是有研究表明，相同条件下的热处理会对不同过敏原产生相反的影响，同时热处理所使用的高温会引起非酶褐变，导致食品营养的流失。非热加工技术不仅可以改变水产品过敏原的构象以消减致敏性，还能够保留水产品原有的特性。而致敏性评价是衡量脱敏效果好坏的标准，只有准确、统一的标准才能使评价结果具有科学性和严谨性。目前国内对水产品过敏评价体系的研究较为匮乏，国外文献中涉及的模型纷繁复杂，难以选择。故本文简单介绍了食物过敏，综述了非热加工技术消减水产品致敏性及其评价方法，以期促进低致敏性水产品的研究和开发。

1 食物过敏

1.1 食物过敏机制

过敏反应的途径一共有三种，包括免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）介导的超敏反应、非IgE介导的超敏反应、IgE 和非IgE 共同介导的超敏反应。大部分水产品的过敏反应属于IgE 介导的超敏反应（Ⅰ型超敏反应），其作用机制包括初始致敏、激发、效应三个阶段，具体作用过程如图1 所示。

图1 Ⅰ型超敏反应机制图Fig.1 Mechanism of type I hypersensitivity

过敏交叉反应是指过敏原（或抗体）除与其相应抗体（或过敏原）发生特异性反应外，还与其他抗体（或过敏原）发生反应，种属关系越近，过敏交叉反应越强。研究表明，有38%的受试者对甲壳类水产品过敏，并且有14%的人同时对甲壳类及软体类水产品过敏，说明过敏交叉反应在水产品过敏中广泛存在。

1.2 水产品中主要的过敏原及其特性

小清蛋白（Parvalbumin，PV）是鱼类主要过敏原之一，分子量通常为10～13 kDa，具有极高的热稳定性。作为鱼体内一种维持细胞内钙离子交换的钙结合蛋白，PV 由其低分子量和高水溶性的特点而得名。不同的鱼类中的PV 具有相似性较高的氨基酸序列，其较高的同源性会诱导机体产生过敏交叉反应。

原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是虾、蟹等甲壳类水产品中最主要的过敏原，分子量在34～38 kDa之间，TM 包含多个肌动蛋白结合位点的稳定超螺旋结构，使其具有耐高温的特性。TM 也具有很高的氨基酸序列同源性，会引起机体的过敏交叉反应。

近年研究中，有许多新型的水产品过敏原被发现：精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）、肌球蛋白轻链（Myosin light chain，MLC）、胶原蛋白（Collagen）、血蓝蛋白（Hemocyanin）等。已报道的部分新型水产品过敏原见表1。

表1 新型水产品过敏原Table 1 New allergens of aquatic products

2 非热加工对水产品致敏性的消减作用

2.1 非热加工技术

非热加工技术是指采用非加热的方法处理食品，使食品达到某种特定要求的加工技术。相比起传统的热加工技术，非热加工技术可以在常温条件下改变过敏原的结构，从而降低水产品过敏原的致敏性。牟慧在研究辐照与热处理对虾免疫原性的影响时，发现热处理不仅不能降低过敏原Pen al 的致敏性，反而随着加热时间的延长，致敏性不断增强，但是辐照可以在不加热的情况下显著降低Pen al 的致敏性。

非热加工技术可分为物理性、化学性和生物性，其中物理性非热加工技术占据主要地位。目前已报道的应用在水产品致敏性研究领域的物理性非热加工技术主要包括超高压、超声波、低温等离子体、辐照等。除了单纯的物理性非热加工技术，化学、生物性非热加工技术也在蓬勃发展，研究发现，酶解法、糖基化修饰等能够对水产品过敏原起到降低致敏性的作用。表2 列举了常用的非热加工技术。

表2 非热加工技术Table 2 Non-thermal processing technologies

2.2 非热加工对水产品致敏性的消减作用

2.2.1 辐照技术 有研究表明辐照处理（1、3、5、7、9 kGy）蟹过敏原TM 之后，其二级和三级结构发生变化，-螺旋和-转角含量下降，-折叠和无规则卷曲含量上升，蛋白结构由折叠变为展开，表面疏水性增强，低剂量辐照对致敏性影响不大，但是随着处理强度的增强致敏性不断下降。另有报道称对虾中过敏原TM 进行辐照处理可使其结构中的-螺旋遭到破坏，部分解旋为-折叠或无规卷曲，二级结构中的无序结构比例上升，表面疏水性增强，最终导致TM 致敏性下降。此外，张立敏研究发现辐照剂量为10 kGy 时，PV 的致敏性降低了95.9%，这表明在安全剂量范围内的辐照能显著降低部分水产品过敏原的致敏性。

2.2.2 超高压技术 超高压技术是食品非热加工技术发展以来应用最为广泛的技术。Zhang 等的研究表明超高压技术可以有效降低鱼类过敏原PV的致敏性，表现在二级结构中-螺旋减少和-折叠增加。张意锋用超高压技术处理鱿鱼过敏原血蓝蛋白，使其二级和三级结构变化，表面疏水性增强，致敏性下降。此外，张意锋等研究了双循环高静压对鱿鱼中的TM 致敏性的影响，结果表明200 MPa以上的双循环高静压都可以有效降低TM 的致敏性。

2.2.3 低温等离子体技术 低温等离子体技术是一种新兴的食品非热加工技术，目前其对于水产品过敏原致敏性的影响研究较少。Ekezie 等利用低温等离子体处理改变了虾过敏原TM 的二级结构，使其-螺旋含量下降，-折叠和无规则卷曲含量上升，同时二硫键形成，自由巯基含量减少，最终使得TM的IgE 和IgG 结合能力下降，故低温等离子体技术可以降低水产品致敏性。

2.2.4 超声波技术 有研究发现超声波对三文鱼过敏原Sal s 1 的二级结构影响不大，但是超声波使其表面疏水性增加，氨基酸残基暴露，致敏性随着处理时间增加而不断下降。另有研究表明经过高强度超声波处理后的TM 中-螺旋含量下降，-折叠和-转角含量上升，TM 的致敏性降低。过敏原普遍对超声波较为敏感，并且温度对超声波处理过敏原的效果有很大影响，如果能够解决参数设置的难题并加以合适的控制，超声波有望成为大规模应用的食品非热加工技术。

2.2.5 糖基化处理（美拉德反应） 糖基化处理（美拉德反应）是最常用的化学性非热加工技术。糖基化处理对水产品过敏原致敏性的消减程度会受到多糖种类、处理时间和温度、过敏原和多糖的比例以及pH 等多种因素影响。Zhang 等研究了糖基化对虾过敏原TM 致敏性的影响，发现使用不同多糖对TM 进行糖基化处理时的致敏性消减效果差距较大，使用麦芽糖对TM 进行糖基化基本不影响致敏性，而使用麦芽七糖对TM 进行糖基化可以大幅度降低致敏性。Shen 等的研究也证明了糖基化可以降低虾过敏原TM 的致敏性，并且降低程度随着处理时间的延长而不断提高。

2.2.6 酶解法 大部分水产品过敏原都是蛋白质，所以目前酶解法的研究大多集中在蛋白酶对过敏原致敏性的消减效果。酶解法的效果主要受到酶的种类和酶解条件的影响。有研究表明不同酶介导的酶解处理对鱼类过敏原PV 的致敏性消减效果有很大的差异，碱性蛋白酶能够显著改变PV 的二级和三级结构，可消除其90%的致敏性，而胰蛋白酶对PV 的二级和三级结构影响较小，致敏性削减效果较差。还有研究用酶解法处理胶原蛋白，使其线性表位和构象表位均遭到破坏，在合适的酶解条件下，胶原蛋白的致敏性基本消失。

3 水产品致敏性评价方法

3.1 血清学方法

过敏原与IgE 结合是过敏原发挥生物活性的中心环节，因此测定过敏原特异性IgE 抗体在过敏症诊断及过敏原评价中具有重要地位，其中酶联免疫吸附法和免疫印迹法是最常用的方法。

3.1.1 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗体分子和抗原分子间的特异性结合特征实现物质的分离检测的一种固相酶分子免疫分析法。ELISA 分类标准并不统一，但可以根据试剂来源、标本形状和检测条件等分为夹心法、间接法、竞争法和捕获法4 种方法。图2 所示是竞争ELISA 的实验流程图。

图2 竞争ELISA 实验流程图Fig.2 Flow chart of competitive ELISA experiment

目前ELISA 已经广泛应用于食品过敏原致敏性的评估并且ELISA 针对不同过敏原可采取不同种类的方法。Zhang 等使用间接ELISA 研究了HHP（200 MPa、20 min）对大西洋鲟鱼过敏原PV 致敏性的影响，结果表明HHP 处理使IgE 和IgG 结合能力相比对照组降低了67%，证明HHP 处理后蛋白质的致敏性显著降低。Li 等探讨了电子束辐照（1、3、5、7、10、13 kGy）对大菱鲆过敏原PV 致敏性的影响，竞争ELISA 实验结果表明特异性IgE 结合百分率降低程度随着电子束辐照剂量的增加而先增大后减小，在10 kGy 剂量下达到最大值91.3%，PV致敏性基本消失。Dong 等使用夹心ELISA 探究了高强度超声波（400 W、20 kHz）对虾过敏原 TM 致敏性的影响，结果显示在20 min 高强度超声处理下TM 致敏性降低76%，这意味着高强度超声波能够显著降低TM 的致敏性。ELISA 在致敏性评价实验中体现出了灵敏性强、操作简单等优点，但ELISA 也有其缺陷，一是交互反应发生的概率较高，二是部分抗体不适合做标记。

3.1.2 免疫印迹法 免疫印迹法（Western blotting，WB）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法分三个阶段进行，包括电泳、电转移和酶免疫定位，具体过程如图3 所示。

图3 免疫印迹法流程图Fig.3 Flow chart of western blotting

ELISA 和WB 是评价水产品致敏性时最常用的血清学方法，在进行过敏原致敏性评估时，WB 常与ELISA 联合使用以提高结果的准确度。Mou 等从虾中提取过敏原Pen a1，研究了-辐照（0 ℃，7、10 kGy）对过敏原的影响，通过WB 和ELISA 分析研究了5 个抗原表位的免疫原性，结果证明辐照可以减少pen a1 的致敏性且辐照剂量越高效果越好。Liu 等通过WB 和ELISA 研究了电子束辐照（3、5、7、10 kGy）对TM 致敏性的影响，两种实验的结果都表明，低剂量的电子束辐照会提高TM 的致敏性，而高剂量的电子束辐照降低了TM 的致敏性。程华峰使用WB 和ELISA 研究了微波、超高压、超声波等不同加工处理方式对中华绒螯蟹中TM 致敏性的影响，结果表明这些加工方式都能降低TM的致敏性。WB 具有分析容量大、敏感度高和特异性强的优点，但是WB 也有缺点，一是操作费时，二是在电转移过程中转移参数设置容错率低，温度过高或者时间过长都会使膜被烧糊。

3.2 细胞实验

细胞实验是一种体外实验，即在活生物体之外的环境中借助细胞进行操作的实验。并不是所有细胞都可以用于致敏性评估实验，在评价过敏原致敏性时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞因为它们在过敏反应中扮演着效应细胞的角色而得到较为广泛的应用。因为肥大细胞在食物过敏反应过程所起到的脱粒作用，所以通过检测血清中组胺等物质的浓度就可以评价过敏原的致敏性。而嗜碱性粒细胞的细胞质内含有嗜碱性颗粒，经抗原刺激后可释放组胺和其他活性物质，通过检测血清中这些活性物质的浓度也可以评价过敏原的致敏性。

大鼠嗜碱性白血病粒细胞系（rat basophil leukemia，RBL）中的一个亚系是 RBL-2H3 细胞，其主要功能和特征与肥大细胞类似，因此常用于水产品过敏反应方面的研究。图4 所示是RBL-2H3 细胞实验的流程图。Huang 等以蓝圆鲹为原料，研究了超声波处理（200 W）、紫外线处理（302 nm、15 W）等不同非热处理方法对PV 致敏性的影响，RBL-2H3 细胞实验的结果表明上述处理方法均可降低PV 致敏性并且美拉德反应和高压联合处理对PV 致敏性的消减最明显。Zhang 等通过RBL-2H3 细胞实验证明了糖基化可以降低TM 的致敏性，表现在组胺和-氨基己糖苷酶释放的减少。RBL-2H3 细胞实验目前已经广泛应用于评价水产品过敏原致敏性的研究中，并表现出可操作性强、均一性好等优点。与传统的食物致敏性评价方法的结果相比，RBL-2H3 细胞实验的结果也显示出良好的一致性，但是有研究证明一些非免疫性刺激也可以导致RBL-2H3 细胞释放组胺等炎症介质，故其有效性还需进一步验证。

图4 RBL-2H3 细胞实验流程图Fig.4 Flow chart of RBL-2H3 cell experiment

3.3 体外模拟消化试验

食物中过敏原的致敏性取决于两个方面，一是过敏原蛋白在通过消化道时的消化稳定性，二是消化产物中具有免疫刺激能力的过敏原表位的丰度。体外模拟消化试验正是通过过敏原在胃肠道中的消化稳定性来间接判断其致敏性。体外模拟消化根据消化单元可分为口腔模拟消化、胃和小肠模拟消化以及大肠模拟消化。

在食物过敏原致敏性评价中最常用的是模拟胃肠液的消化试验。Jin 等探究了HHP 处理（20 min，200、400 和600 MPa）对TM 致敏性的影响，该研究使用模拟胃液消化和模拟肠液消化试验来测定TM消化稳定性的变化，对消化后的产物进行分析，发现TM 随着消化片段的形成而逐渐减少，证明HHP 确实降低了TM 的致敏性。另有研究探讨了高强度超声波处理（100～800 W、15 min）对TM 致敏性的影响，通过模拟肠胃液消化试验证明了高强度超声波处理显著降低了TM 的致敏性。体外模拟消化实验虽然无法对体内消化过程做到高度还原，但其具有操作简单、快速、价格低廉、实验周期短、可重复性高等优点。因此，目前许多过敏原致敏性的研究中都会使用体外模拟消化来进一步研究其致敏性的变化。

3.4 动物实验

动物实验是指利用具有人类疾病模拟表现的动物进行实验的实验方法。图5 所示为动物实验基本流程图。小鼠是最常用的实验动物，这不仅是因为小鼠繁殖周期短、易饲养，也是因为小鼠拥有和人相近的生理学表现。应用于水产品致敏性评价的小鼠品系包括C57BL/6、C3H/HeJ、DBA2、BALB/c 等。

图5 动物实验基本流程图Fig.5 Basic flow chart of animal experiment

BALB/c 小鼠起源于小家鼠，是近交高IgE 应答品系，优先产生Th2 型免疫应答和IgE 抗体，是最常被用来判定蛋白质致敏性的小鼠品系。Zhang 等使用雌性BALB/c 小鼠模型研究了糖基化处理对虾中TM 致敏性的影响，与TM 相比，经过糖基化处理的TM 致敏性显著降低并且使用麦芽五糖进行糖基化的TM 致敏性降低程度最高。Zhang 等通过雌性BALB/c 小鼠模型试验研究了糖基化和脱糖基化处理对TM 致敏性的影响，实验结果表明脱糖基化加重了TM 的致敏性，糖基化则降低了TM 的致敏性。孙佳益等使用BALB/c 小鼠模型试验探究了利用无花果蛋白酶酶解TM 对其致敏性的影响，发现酶解使得IgE 的结合能力降低77.83%，表明使用无花果蛋白酶进行酶解是一种有效降低TM 致敏性的方法。

动物实验是深入研究过敏原致敏性时必不可少的一种实验方法，其优势在于避免了在人体上进行实验所带来的风险并且实验结果更接近实际情况。但是只采用一种类型的小鼠用于致敏性评价动物实验存在一定缺陷，Morafo 等研究发现给予BALB/c小鼠和C3H/HeJ 小鼠灌胃过敏原，后者的特异性IgE 水平在致敏后的第6 周显著性升高，而前者特异性IgE 水平只略高于对照组小鼠。因此，在进行动物实验时最好能够利用不同种类的小鼠进行实验以确保实验结果的准确性。此外，致敏途径也会影响动物实验结果的准确性，在设计实验时要合理选择致敏途径，有研究表明腹腔注射TM 比口服灌胃更易使BALB/c 小鼠致敏，更适合于构建用于食物致敏性评价的动物模型。

4 总结

综上所述，虽然非热加工技术能够有效降低水产品致敏性，但是目前用于消减水产品过敏原致敏性的技术都存在一定的局限性，通过研究不同非热加工技术降低水产品致敏性的机理，开发综合性加工方法以完全消除水产品致敏性并确保水产品的安全性是今后研究的重点方向。从过敏反应的过程着手并结合水产品过敏原构象的变化，通过血清学方法、体外模拟消化和细胞实验以及体内动物实验构建多级致敏性评价模式，深入研究过敏原构象变化和致敏后炎症介质变化之间的关联性，从而进一步揭示非热加工对水产品致敏性的影响规律，为有效降低水产品致敏性提供理论依据。