QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中六溴环十二烷

沈菲，朱峰，吉文亮

(江苏省疾病预防控制中心，江苏 南京 210009)

近年来，随着化工行业迅速发展，化学产品带来的环境问题受到了普遍关注。为了提高可燃材料的耐燃性，各种阻燃剂被广泛应用，使用量也在大幅度上升[1]。六溴环十二烷(HBCD)作为添加型溴系阻燃剂，是世界用量第三的阻燃剂产品，仅次于十溴二苯醚和四溴双酚A，主要使用在热塑性塑料、家具装饰材料和电子产品中[2]。HBCD具有高生物蓄积性、持久性和毒性，且易从产品的生产、使用、处理等各个过程中释放出来，目前已被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》的受控名单，因此对HBCD进行监测和暴露风险评估的研究受到国内外关注[3-4]。

近年来，水产品(鱼、虾、贝母、紫菜、海带等)中HBCD的监测成为国内外研究的热点，但大多数实验笼统地把所有水产品当作一种基质。而水产品样品基质较为复杂，不同品种对目标物灵敏度的影响也不同，例如，鳗鲡的脂肪含量较高，虾的色素含量较高[5]，因此应根据水产品的品种而调整前处理方法。水产品中HBCD的常用提取方法包括索氏提取法、超声提取法和加速溶剂萃取法等，常用净化方法包括凝胶色谱分离法、柱析法、硫酸净化法和酸性硅胶净化法等。传统的提取、净化方法，操作较为烦琐、费时[6-7]。QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)方法建立了稳定有效的提取和净化方法，可减少前处理操作步骤和试剂的消耗[8-10]，已广泛应用于农产品中农药的残留分析，但是应用于水产品中HBCD的分析检测较少[11]。商品HBCD由α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD这3种异构体组成。HBCD在160 ℃以上时会发生热重排，导致3种异构体间互相转化，在240 ℃以上时会出现脱溴降解现象，目前超高效液相色谱-串联质谱法已普遍应用于HBCD异构体的测定[12-15]。

现对QuEChERS前处理净化方法进行优化，建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中HBCD的方法，以期为水产品中HBCD的测定提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：LC-30A型超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；QTRAP 5500型三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)；1-14型台式离心机(美国Sigma公司)；OA-SYS型氮吹仪(美国Organomarion公司)；Vortex-Genie 2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；EMR-Lipid增强型脂质去除净化管(美国Agilent Technologies公司)；ACQUITY UPLC BEH型 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm，美国Waters公司)。

试剂：硫酸钠、氯化钠、硫酸镁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18粉末、石墨化炭黑(GCB)(上海安谱实验科技股份有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；HBCD(α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD)及其同位素标记物(13C12-α-HBCD、13C12-β-HBCD、13C12-γ-HBCD)(50 μg/mL，美国Wellington公司)。

1.2 样品处理

准确称取2 g(精确至0.001 g)均质过的鱼肉样品至50 mL离心管中，加入100 μL 250 ng/mL的13C12-α-HBCD、13C12-β-HBCD和13C12-γ-HBCD混合内标溶液，依次加入5 mL水和10 mL 乙腈，涡旋振荡提取10 min。加入盐析剂(4 g硫酸钠，1 g氯化钠)，涡旋振荡2 min，10 000 r/min 离心5 min。取1.5 mL上清液至2 mL 装有150 mg 硫酸镁、100 mg C18、100 mg PSA和5 mg GCB的净化管中，涡旋振荡2 min，14 800 r/min 离心5 min。取0.8 mL上清液氮吹至尽干，用 0.4 mL 的乙腈-水(V∶V=2∶8)溶液复溶，涡旋混合2 min，过0.22 μm微孔滤膜后待测。

1.3 实验条件

色谱条件：流动相A为水，流动相B为甲醇-乙腈(V∶V=50∶50)。梯度洗脱程序：0～0.5 min，5%～40%B；0.5～1 min，40%～90%B；1～5 min，90%～92%B；5～5.1 min，92%～5%B；5.1～7 min，5%B。流量为0.3 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI源)；扫描方式为负离子扫描；监测模式为多反应检测扫描(MRM)模式；毛细管电压为-4 500 V；离子源温度为550 ℃；气帘气流量为31.8 L/min；雾化气流量为8.4 L/min；辅助气流量为6.8 L/min。HBCD及其同位素标记物的质谱参数见表1。

表1 HBCD及其同位素标记物的质谱参数(1)* 为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件与液相色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件优化

采用针泵方式进样，将1 μg/mL的HBCD及其同位素标记物的各单标溶液以7 μL/min的流量注入离子源，负离子模式下，分别进行Q1母离子和Q3子离子扫描，选取最合适的离子对，优化去簇电压、碰撞电压等参数，得到最佳质谱参数。

2.1.2 液相色谱条件优化

α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD属于同分异构体，具有相同的离子对信息，质谱参数相同，须优化液相色谱条件来实现HBCD及其同位素标记物的有效分离。考察不同比例的甲醇-乙腈(V∶V=20∶80，50∶50，60∶40)作为有机相对化合物分离的影响。实验表明，有机相比例达到90%时，色谱峰的峰宽较窄，峰型尖锐；有机相比例超过92%时，α-HBCD、β-HBCD较难分离。不同比例的甲醇-乙腈均能实现化合物分离，V∶V=50∶50的甲醇-乙腈作为有机相时，信号响应最强，分离时间最佳。基于以上条件确定了梯度洗脱程序，HBCD的多反应色谱图见图1。

图1 HBCD的多反应色谱图

2.2 前处理方法优化

2.2.1 EMR-Lipid填料的选择

鱼肉样品中的脂肪成分在提取过程中会被一起提取出来，不利于QuEChERS的净化。在盐析提取前加入EMR-Lipid用于去除样品中的脂类物质，可有效提高净化效率[16]。在盐析提取前加入2 g EMR-Lipid填料，以外标法定量，每个实验重复3次，EMR-Lipid填料对HBCD绝对回收率的影响见图2。由图2可见，不加EMR-Lipid填料时，α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD的绝对回收率均比加入EMR-Lipid填料时高。因为鱼肉的脂肪含量不高，加入EMR-Lipid填料对HBCD没有起到增强净化的作用，因此在本实验样品处理过程中不使用EMR-Lipid填料。

图2 EMR-Lipid填料对HBCD绝对回收率的影响

2.2.2 GCB、C18、PSA用量的选择

2.2.2.1 GCB对HBCD绝对回收率的影响

固定PSA、C18用量均为100 mg，考察GCB(5，10，15，20 mg)对HBCD绝对回收率的影响，以外标法定量，每个实验重复3次(图3)。由图3可见，α-HBCD、γ-HBCD的绝对回收率随着GCB的增加逐渐降低，原因是GCB用量过大易导致目标物被吸附，较难洗脱。β-HBCD的绝对回收率在GCB用量为10和15 mg时远远超过100%，存在明显的基质增强效应。基质增强效应虽然可增大目标物的响应，对低浓度目标物的检测有利，但会对仪器造成污染，增加仪器的维护频率。由此可见，GCB用量较大时对β-HBCD产生的基质效应不利于仪器维护，因此选择GCB用量为5 mg。

图3 GCB对HBCD绝对回收率的影响

2.2.2.2 C18对HBCD绝对回收率的影响

固定PSA用量为100 mg、GCB用量为5 mg，考察C18用量(50，100，150，200 mg)对HBCD绝对回收率的影响，以外标法定量，每个实验重复3次(图4)。由图4可见，由于C18过量易导致目标物被吸附，α-HBCD、γ-HBCD的净化效果并没有随着C18用量的增大而增大，100 mg C18的净化效果最佳。C18用量为150 mg时，β-HBCD的绝对回收率远大于100%，存在明显的基质效应，因此选择 C18用量为100 mg。

图4 C18对HBCD绝对回收率的影响

2.2.2.3 PSA对HBCD绝对回收率的影响

固定C18用量为100 mg、GCB用量为5 mg，考察PSA用量(50，100，150，200 mg)对HBCD绝对回收率的影响，以外标法定量，每个实验重复3次(图5)。由图5可见，由于PSA过量易导致目标物被吸附，100 mg PSA对α-HBCD、γ-HBCD的净化效果最佳，继续增加用量对净化效果改善不大，反而有降低的趋势。PSA用量为150 和200 mg时，β-HBCD存在明显的基质效应，因此选择PSA用量为100 mg。

图5 PSA对HBCD绝对回收率的影响

2.3 基质效应

采用空白鱼肉基质提取液和空白溶剂分别配制质量浓度为0.5，2，5，20和50 μg/L的系列标准溶液，2条标准曲线的相关系数均>0.99。基质效应(ME)以公式ME=(基质标准曲线斜率-空白溶剂标准曲线斜率)/空白溶剂标准曲线斜率×100%[17-18]计算，α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的ME分别为4.36%，-0.16%和0.58%。当0<|ME|<20%时，基质效应弱，因此可用空白溶剂配置标准曲线进行定量。结果表明，对于方法优化后经前处理净化的鱼肉样品，基质效应对其中HBCD的测定影响不显著，可以保证实验定性和定量的准确度。虽然样品前处理方法对基质效应影响不大，但是对γ-HBCD的绝对回收率有影响(绝对回收率<75%)，综合考虑，采用同位素稀释法进行校正。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

采用空白溶剂配制质量浓度为0.5，2，5，20和50 μg/L的系列标准溶液，进样分析，线性范围均为0.5～50 μg/L，相关系数均>0.999。

在空白鱼肉基质中加入10 μL 250 ng/mL的α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD混合标准溶液，按照1.2节进行前处理后，按照1.3节进行分析，以监测离子对色谱峰的信噪比(S/N)=3时对应的加标水平为检出限，α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD 的检出限分别为0.23，0.27和0.05 μg/kg。以S/N=10时对应的加标水平为定量下限，α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的定量下限分别为0.77，0.91和0.17 μg/kg。

2.5 准确度和精密度

在空白鱼肉样品中加入3个质量分数(2.5，12.5，25 μg/kg)的混合标准溶液，按照1.2节进行前处理，按照1.3节进行分析，每个质量分数重复实验6次，用同位素稀释法定量。3个质量分数加标实验中，α-HBCD的回收率分别为107%，106%，105%，相对标准偏差分别为6.6%，1.4%，0.7%；β-HBCD的回收率分别为106%，104%，99.3%，相对标准偏差分别为8.4%，2.4%，1.2%；γ-HBCD的回收率分别为99.9%，99.5%，99.7%，相对标准偏差分别为3.7%，0.4%，4.6%。结果表明，方法的准确度和精密度均良好。

2.6 实际样品检测

实际样品为购自超市和菜场的鱼肉5份，按照上述方法进行分析测试。结果表明，样品中均未检出β-HBCD和γ-HBCD，α-HBCD质量分数为0.3～1.2 μg/kg(湿重)。有研究表明，水生生物组织里的α-HBCD占HBCD总量的80%以上，这与3种HBCD在生物体内代谢的快慢有关[19]。本实验结果反映的趋势与该文献报道一致。

3 结语

建立了QuEChERS样品前处理方法和超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中HBCD的方法，采用同位素稀释法定量，方法检出限为0.05～0.27 μg/kg，定量下限为0.17～0.91 μg/kg，加标回收率为 99.3%～107%，相对标准偏差为0.4%～8.4%。此方法简便准确、灵敏度高、精密度好，具有较高的回收率，可满足鱼肉中HBCD的检测要求。