蒲公英根提取物对菜籽油的抗氧化效果

王建芳，曹 让，辛清婷，蒋亚辉，杨培志

（西北农林科技大学草业与草原学院, 陕西 杨凌 712100）

蒲公英(Taraxacum mongolicum)是菊科多年生草本植物，属于国家中草药保护品种之一，也是国家卫计委公布的药食同源的材料之一。研究表明，蒲公英不仅含有丰富的碳水化合物、蛋白质、多种维生素及矿物质等营养成分，还富含多酚类、多糖类、甾醇类、萜类等多种功能性成分，呈现出抗氧化、抗衰老、抗炎抗菌、提高机体免疫力等功效[1-3]。因此，蒲公英在我国许多地方都有不同规模的人工种植，作为蔬菜或被加工成各种保健食品。蒲公英的根系能够在地下生长多年，富集和贮存更多的功能活性物质，是很好的中药材，我国民间自古就有人用蒲公英根泡水或泡酒喝的习惯，具有强身健体、延年益寿的功效。蒲公英根提取物具有较好的抗氧化作用[4-6]，但目前国内外对蒲公英根的研究和开发利用仍相对较少。笔者运用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法对蒲公英根的乙醇提取物进行检测分析发现，其中含有丰富的多酚类物质以及蒲公英甾醇等抗氧化活性成分。

自20 世纪80 年代以来，中国油菜(Brassica napus)种植面积和总产量均居世界第一位，菜籽油也成为我国居民最主要的食用油之一。食用油脂在日常食用和贮存过程中，常常会受到环境中光、热、湿以及微生物等的影响而产生过氧化和酸败等问题，严重影响油脂的品质和食用安全性。为此，我国食用油标准(GB2760-2014) 允许添加一定剂量的抗氧化剂，常用的有丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ) 等食品添加剂。这些人工合成的化学添加剂虽然表现出了较好的抗氧化效果，但是研究发现，这类物质对人体多脏器具有毒害性，甚至具有潜在致癌风险[7-8]。因此寻找绿色天然抗氧化添加剂已成为食品科技领域的热门课题[9-11]。而植物多酚类物质因同时具有抗氧化作用和抗炎、抗衰及预防心脑血管疾病等保健功能[12]，近年来更多地受到关注。

基于此，本研究将蒲公英根提取物以不同质量分数添加到成品菜籽油中，采用Schaal 烘箱加速氧化法[10]，通过油脂过氧化值(POV)、酸价(AV)、硫代巴比妥酸(TBA)值等过氧化指标的变化，结合观察油脂外观和气味的变化，并与常用的市售油脂抗氧化剂进行比较，考察蒲公英根提取物对食用油的抗氧化效果，旨在探寻一种更加安全有效的天然食用油抗氧化剂，同时为蒲公英根的开发利用拓展新的领域和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英：西北农林科技大学草业科学系试验田繁育种植的蒲公英。菜籽油：陕西眉县菜籽油厂生产的物理压榨成品菜籽油，未加入任何食品添加剂。食用油抗氧化剂：市售食品级BHA、BHT 及维生素E 油(VE)。标准品及试剂：绿原酸、咖啡酸、芦丁、蒲公英甾醇等均为上海源叶生物科技有限公司生产的标准品；甲醇、乙腈、异丙醇等均为市售色谱纯试剂；乙醇、无水乙醚、冰乙酸、异丙醇、三氯甲烷、碘、碘化钾、硫代硫酸钠、氢氧化钠、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)等均为市售分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(Thermo Ultimate 3000)，配有Chameleon7 色谱工作站；高速冷冻离心机(Eppendorf 5424R)；真空旋转蒸发仪(BUCHI R-215)；紫外可见分光光度计(岛津UVmini-1280)；集热式恒温磁力搅拌水浴器(DF-101S) 及索氏提取装置；恒温鼓风干燥箱；超微粉碎机；万分之一分析天平等。

1.3 试验方法

1.3.1蒲公英根提取物的制备

采挖生长3 年的蒲公英根，洗去泥土，切片(段)，于恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干，用超微粉碎机粉碎至可过0.178 mm 筛，称取适量，滤纸包好，采用索氏提取法，以95%乙醇抽提4 h，然后将提取液经减压旋转蒸发浓缩至无溶剂，得到蒲公英根提取物(以下简称提取物)，计算平均得率，并测定其相关的理化指标。最后密闭保存在0～4 ℃冰箱备用。

1.3.2 提取物中抗氧化活性成分检测

参考国家药典及相关文献中相应物质的检测方法[13-15]，将以上制备的蒲公英根提取物及绿原酸、咖啡酸、蒲公英甾醇等标准品分别精密配制成400 μg·mL-1的溶液，并根据仪器响应值配置成一定比例的混合标准品溶液，利用高效液相色谱仪对提取物中的主要抗氧化活性成分进行分离检测。

多酚类物质检测的色谱条件。色谱柱：BDS Hypersil C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇 ∶0.4%磷酸(40 ∶ 60)，等度洗脱，流速0.8 mL·min-1；运行时间15 min；柱温35 ℃；紫外检测器检测波长327 nm；进样量2 μL。“一测多评法”[16]同时检测提取物中绿原酸、咖啡酸和总黄酮等多酚类物质的含量。

甾醇类物质检测的色谱条件。色谱柱：BDS Hypersil C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇 ∶异丙醇(75 ∶ 25)，等度洗脱，流速1.0 mL·min-1；运行时间13 min；柱温30 ℃；紫外检测器检测波长205 nm；进样量15 μL。检测提取物中甾醇类物质的含量。

1.3.3 油脂抗氧化试验

不同质量分数的提取物添加，对菜籽油的抗氧化效果。精密称取0.01、0.02、0.03 g 的提取物分别添加到100 g 纯菜籽油中，充分搅拌溶解后，敞口置于(65 ± 1) ℃的恒温鼓风干燥箱中，每周(即第0、7、14、21、28 及35 天) 分 别 取 样 测 定POV、AV、TBA 值等指标，并观察其外观及气味的变化情况。同时设置不添加提取物作为空白对照(CK)。

相同质量分数的不同抗氧化剂添加，对菜籽油的抗氧化效果。按照国家标准规定，BHA、BHT 允许添加量为0.2‰，故精密称取0.02 g 的BHA、BHT、提取物和VE 油分别添加到100 g 纯菜籽油中，充分搅拌溶解后，敞口置于(65 ± 1) ℃的恒温鼓风干燥箱中，每周(即第0、7、14、21、28 及35 天)分别取样测定各油样的过氧化值(POV)、酸价(AV)、硫代巴比妥酸(TBA)值等指标，并观察其外观及气味的变化情况。同时设置不添加抗氧化剂作为空白对照组(CK)。

1.3.4 抗氧化指标的测定

POV 的测定与计算是依据GB 5009.227-2016 食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》第一法[17]进行，按照要求根据样品性质稍作调整。最后以1 kg油样中活性氧的毫摩尔数表示POV。

AV 的测定与计算：依据GB5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》第一法[18]进行，按照要求根据样品性质稍作调整。以1 g 油样中酸性物质可中和氢氧化钾的毫克数表示AV 值。

TBA 值的测定与计算：按照GB/T35252-2017《动植物油脂2-硫代巴比妥酸值的测定》直接法[19]进行，按要求根据样品性质稍作调整。最后以1 g 油样与TBA 试剂反应所测得吸光度值表示TBA 值。

1.4 数据分析

提取物中活性成分检测由Chameleon7 色谱工作站给出色谱图及其定量分析结果；油样各抗氧化指标分别进行3 次独立重复测定，结果以平均值 ±标准误表示，采用Excel 2013 对数据进行计算及作图分析，采用SPSS 20 进行数据统计及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蒲公英根提取物的性状

蒲公英根经过粉碎、提取并浓缩后，得到一种略具清香气味儿的琥珀色油状浸膏，平均得率为13.25%，测得其相对密度1.103 g·mL-1(20 ℃)；试验显示，这种与植物油色泽状态接近的提取物，以0.5‰以下的剂量添加，经充分搅拌后可与菜籽油互溶，对菜籽油的外观、色泽及气味等无不良影响。

2.2 提取物中抗氧化活性成分的检测结果

多酚类物质的 HPLC 检测结果如图1 所示，提取物中含有大量的多酚类物质，共识别出5 种组分，其相对峰面积分别为绿原酸25.77%、咖啡酸22.60%、异绿原酸A 18.23%、黄酮1.09%、异绿原酸C 5.49%；甾醇类物质的HPLC 检测结果如图2 所示，提取物中含有一定量的蒲公英甾醇，其相对峰面积13.28%。

图1 提取物中多酚类物质检测色谱图Figure 1 Chromatogram of polyphenols in extract

图2 提取物中甾醇类物质检测色谱图Figure 2 Chromatogram of sterols in extract

经以上高效液相色谱分析，明确了蒲公英根提取物中含有酚酸类、黄酮类及甾醇类等多种具有抗氧化活性的还原性物质，各组分的HPLC 定量结果为绿原酸17.72 mg·g-1，咖啡酸6.90 mg·g-1，异绿原酸A 10.06 mg·g-1, 异绿原酸C 3.51 mg·g-1，总黄酮2.70 mg·g-1，蒲公英甾醇8.22 mg·g-1。其中含量最高的为绿原酸，其次为异绿原酸A 和蒲公英甾醇。

2.3 油脂抗氧化试验结果

2.3.1 不同的提取物添加量对菜籽油的抗氧化效果

分别添加了0.1‰、0.2‰及0.3‰提取物的处理组和零添加的空白对照组，各项过氧化指标在前两周变化都不明显，至21 d 左右各组各项指标均开始上升，上升幅度有所不相同(表1)。28 d 后，各处理组的POV、TBA 值和AV 值基本显著低于空白对照组(P＜ 0.05)，且随添加量的增加抗氧化效果明显增强。说明一定质量分数的提取物添加对菜籽油各项过氧化指标的上升具有很好的抑制作用，且呈现显著的量效关系。

表1 不同的提取物添加量对菜籽油抗氧化效果差异显著性分析Table 1 Significance analysis of antioxidant effects of different doses of extract on rapeseed oil

2.3.2 相同添加量的不同抗氧化剂对菜籽油的抗氧化效果

分别添加了0.2‰的不同抗氧化剂的处理组和不添加的空白对照组，各项过氧化指标在前两周变化都不明显(表2)，21 d 左右开始逐渐上升，上升幅度各不相同。28 d 后，POV 值大小排序为CK ＞ VE ＞BHA ＞ 提取物 ＞ BHT，提取物和BHT 添加组显著低于其他组(P＜ 0.05)，且二者差异不显著(P＞ 0.05)；TBA 值大小排序为CK ＞ VE ＞ BHT ＞ 提取物 ＞ BHA，除VE 添加组和对照组无显著差异，其他各添加组均显著低于对照组，其中最低组BHA 和提取物添加组间无显著差异；35 d 后，AV 值大小排序为CK ＞VE ＞ BHA ＞ BHT ＞ 提取物，除VE 添加组和对照组无显著差异，其他各添加组均显著低于对照组。以相同质量分数0.2‰分别添加，提取物对菜籽油POV 值的抑制能力比BHA 和VE 强，较BHT 稍弱；对TBA 值的抑制能力比BHT 和VE 强，较BHA 稍弱；对酸价的抑制能力比BHA、BHT 和VE 都略强。

表2 相同添加量的不同抗氧化剂对菜籽油抗氧化效果差异显著性分析Table 2 Significance analysis of antioxidant effects of different additives with the same dose on rapeseed oil

3 讨论与结论

3.1 酸价的变化

本研究中，所有油样的酸价变化在前期都表现得很平稳，直到第28 天后才开始缓慢上升，直至35 d对照组才上升了38%，与其他指标相比，酸价的变化很小。出现这种现象可能有两方面的原因：一是由于在试验过程中，烘箱环境只提供了温度和流动空气(氧气)等促氧化条件，而缺少了湿度和微生物条件，因而减缓了油脂的酸败；二是因为本研究采买的菜籽油为新鲜压榨，且未经过精炼提取，保存了菜籽中原有的维生素和甾醇类等具有天然抗酸败能力的物质[20-21]，缓冲了油脂的酸败。具体原因还有待于进一步观察和研究。

3.2 VE 的抗氧化效果

维生素E 是人体必需的一种脂溶性维生素，在人体内能清除自由基，延缓衰老，具有很好的抗氧化效果，因而常被用来作为食用油的抗氧化添加剂[9-11]，但在本研究中的抗氧化效果却不显著，这种情况，许腾[22]和孙逸雯等[23]之前也曾报道过。李甜甜等[24]研究认为，VE 在氧和自由基中长时间暴露，可能会生成一系列对油脂具有促氧化作用的产物，从而加速油脂的过氧化和酸败进程；根据马齐兵等[25]的检测结果，未经精炼的菜籽毛油中维生素E的含量高达427.4 mg·kg-1，这就意味着纯物理压榨菜籽油天然就含有丰富的维生素E，而试验中再进行人工添加VE，其抗氧化效果就显现不出来了，这可能是VE 在本研究中的抗氧化效果不显著的另一个原因。由此看来，对于纯压榨菜籽油而言，无需再添加VE 作为其抗氧化剂。

3.3 蒲公英根提取物对菜籽油的抗氧化效果

本研究由蒲公英根中获得一种琥珀色油状提取物，经高效液相色谱分析，其中含有丰富的多酚类及甾醇等抗氧化活性成分。多酚类物质大多自身极易被氧化，可充当还原剂降低油脂中的含氧量，还能充当单线态氧抑制剂、金属离子螯合剂、自由基清除剂等众多角色抑制油脂的氧化劣变[26]，相比人工合成抗氧化剂只提供单一活性羟基基团，天然多酚类物质可以提供较多的活性酚羟基，能形成较多的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基，来抑制脂肪氧化的进行[27-28]，其中的绿原酸属于较强的酚型抗氧化剂，研究表明，其抗氧化能力要强于对羟苯酚、阿魏酸、丁香酸、BHA 和VE 等[29]；而植物甾醇也是一类对人体非常有益的具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及调节激素和代谢等作用的物质，广泛存在于植物的种子、花和根系中[30]。李婧雯和包怡红[4]也在蒲公英根中提取到甾醇。许腾[22]也曾研究报道过植物甾醇对食用油脂具有很好的抗氧化效果。此外，陆长梅等[31]曾检测出蒲公英根中还含有Vc 及多种抗氧化酶(SOD、POD、CAT)等抗氧化活性成分。并且，有多项研究证实，多种抗氧化物质共存时可以产生很好的协同抗氧化作用[32-33]。因此认为，本研究获得的蒲公英根提取物是一种复合型天然抗氧化剂。

本研究表明，蒲公英根提取物对菜籽油具有显著的抗氧化效果，且随添加量的增加而增强(P＜0.05)；以相同质量分数(0.2‰)添加，蒲公英根提取物对菜籽油过氧化值的抑制作用较BHA 和VE 强(P＜ 0.05)，对硫代巴比妥酸值的抑制作用较BHT和VE 强(P＜ 0.05)，对酸价的抑制作用较BHA、BHT和VE 都略强(P＞ 0.05)。进一步说明蒲公英根提取物作为食用油抗氧化剂不仅具有天然物质基础，而且具有良好的实际效果。

如果以蒲公英根为原材料，对其主要抗氧化活性成分进一步精准提取和分离纯化，并根据各成分的抗氧化功效进行有机组合，再结合实际应用技术进行研究开发，将有望获得一种绿色天然的新型食品抗氧化剂，以取代化学合成的抗氧化添加剂。