浙江省50份甜玉米核心种质资源遗传多样性分析

陈晓龙， 应多， 包斐， 方瑞秋

(浙江省农业科学院 玉米与特色旱粮研究所，浙江 东阳 322100)

甜玉米作为普通玉米育种改良后的产物，不仅营养丰富，而且由于其果皮薄、口感脆甜、皮渣率低等特点，能克服普通玉米的很多缺点，起到改善人们膳食结构的作用，因此，越来越被大众所喜爱，然而大部分的甜玉米自交系并没有详细系谱记载，极大地影响了后续种质改良及其杂交组合组配，使其育种效率大大降低[1]。玉米的生产模式是杂种优势利用[2]，借助这种模式可以显著提高鲜食玉米的品质以及产量，同时，不同杂种优势群之间杂交后代表现出的杂种优势存在一定差异[3]，因此，合理充分地利用甜玉米的杂种优势就需要对杂种优势群进行准确划分并建立对应的杂种优势模式[4]。

传统的育种方式依靠田间农业性状调查结果，对实验的自交系类群进行表型聚类分析，其结果与系谱图比较存在一定误差，其可靠性仍值得商榷。但DNA分子标记技术的出现，为种质资源遗传多样性研究提供了新的手段。其中SSR标记由于基因组中分布广泛、标记无功能、标记序列两侧顺序较保守、共显性遗传以及DNA质量要求低等特性，已逐渐被育种家们广泛使用[5]。在SSR引物的开发上，杨珊等[6]利用20份自交材料的24个SSR引物筛选出了4个对玉米耐盐碱性相关的SSR引物。李余良等[7]从玉米基因数据库中开发了251对SSR引物，电泳检测出12对关于雌穗发育差异的高多态性SSR引物。在SSR引物的应用上，张微微等[8]利用筛选出的40对SSR核心引物对213份背景模糊的鲜食玉米进行遗传多样性分析，将213份鲜食玉米品系划分为3大类群，其结果与自交系谱系及来源相符。

本研究利用北京农林科学院玉米研究中心研发的针对中国玉米种质开发的40对SSR核心引物对50份浙江省农业科学院玉米与特色旱粮研究所搜集的甜玉米自交系进行遗传多样性分析，并依据结果进行针对性地组合配对实验，为合理挑选优良甜玉米自交系和选育新品种提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用的50份甜玉米自交系都来自于浙江省农业科学院玉米与特色旱粮研究所且都是通过多代自交纯化而来，遗传性状良好稳定。

1.2 DNA的提取与检测

分别取50份甜玉米自交系的籽粒10颗，在恒温光照培养箱里恒温培养，待生长至3叶期时，同一自交系混合取样，液氮磨成粉末，采用CTAB法抽提DNA[9-10]，并通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000分光光度计进行检测。

1.3 40对SSR核心引物的合成与多态性统计分析

选用的SSR引物为北京农林科学院玉米研究中心针对中国玉米种质开发的40对核心SSR标记[11-12]，引物名称及序列见表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过提取的50份甜玉米自交系DNA进行PCR扩增，产物用8.0%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，180 V恒压电泳1.5～4.0 h，并利用银染显色[13]。扩增产物以“0、1、2”统计建立数据库，在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，数据缺失记为“2”。标记位点的多态性信息量(PIC)按公式PIC=1-∑fi2计算，其中，fi表示某标记位点第i等位基因的基因频率[14]。利用软件NTsys 2.10e处理数据，并按UPGMA(unweight pair group method arithmetic averages)方法进行聚类分析。

表1 40对核心SSR标记的引物序列

2 结果与分析

2.1 SSR标记结果分析

近年来，SSR分子标记技术在B73、Mo17等骨干玉米自交系基因组序列的公布下得到了广泛的应用[15]，截至目前，已有2 000多对玉米SSR引物发布于MaizeGDB，对所获得的SSR引物用PCR进行扩增，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，将所扩增出来的微卫星片段进行观察比较，可清晰且高效地应用于甜玉米自交系的遗传多样性分析。如表2所示，40对SSR核心标记引物在50份甜玉米自交系材料中进行扩增，共检测到228个等位基因变异，不同的SSR标记检测到的等位基因变异为3～13个，平均为5.65个。40对SSR标记引物位点的PIC值变化范围在0.32～0.89，平均为0.59，其中，以扩增SSR引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4为例(图1)，在聚丙烯凝胶图中发现该SSR标记可以扩增出清晰稳定的多态性条带。以上结果证明，实验的SSR标记具有高度的变异性，可以较好地满足本实验的要求。

表2 40对核心SSR引物的等位基因与多态性信息量

A、B、C分别代表引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4对部分甜玉米自交系的扩增。

2.2 50份甜玉米自交系的聚类划分

现阶段面临的现状是新品种的选育遗传基础狭窄，国内外种质资源未进行有效整理和分类，极大地抑制了种质的扩增、改良与创新[16]。因此，在育种中将拟组配用的甜玉米自交系材料先进行遗传多样性分析，再结合杂交优势原理组配杂交组合，有助于更高效地选育出优良玉米品种。本研究利用NTsys 2.10e软件计算出50份甜玉米自交系材料的遗传相似系数，并通过UPGMA法进行聚类分析。由表3可知，在相似系数为0.57时，可将以上50份甜玉米自交系材料划分为6大类，分别是包含33个亲本的第Ⅰ大类、4个亲本的第Ⅱ大类、3个亲本的第Ⅲ大类、4个亲本的第Ⅳ大类、5个亲本的第Ⅴ大类和1个亲本的第Ⅵ大类。

表3 50份甜玉米自交系聚类分析结果

2.3 优良甜玉米自交系的组合配对实验

研究现有不同种质(品种)的遗传多样性，对深入剖析及挖掘优异品种的基因组成和提高育种效率具有重要的理论和实践意义[17-18]。通过前期对实验材料的表型鉴定，筛选出具有代表性的优质甜玉米自交系，并结合聚类划分结果选择亲缘关系较远的自交系进行组合配对实验。结果如图2，以57和59的杂交组合为例，相比于父本和母本，杂交组合F1植株更加高大、强壮，果穗籽粒数量显著增加且更加饱满。由表4可知，参与实验的10组杂交组合F1在株高、穗位高、穗行数、行粒数、穗长、穗粗、茎粗等农艺性状上都表现良好。这些结果暗示着聚类划分能更好地辅助育种人员进行甜玉米自交系材料的选配，并结合杂种优势在甜玉米品质、产量、抗性方面的提升作用，能更好地用于选育性状优良的甜玉米品种。

图2 甜玉米自交系F1杂交后代农艺性状

表4 甜玉米自交系F1杂交后代性状调查

3 小结与讨论

3.1 甜玉米遗传多样性分析的意义

遗传多样性分析可以辅助育种家更全面地了解甜玉米种质资源的遗传背景，是选育优良甜玉米品种的重要前提。甜玉米作为甜质型玉米亚种，籽粒含糖量高、口感脆甜，富含维生素、游离氨基酸和矿物质，是一种深受广大消费者青睐的玉米类型。然而，我国在甜玉米育种上还存在较多问题，例如种质资源匮乏、耐热和耐寒品种较少等[19]，极大地抑制了优质甜玉米品种的开发和应用。持续引进和鉴定出与当前主导种质遗传距离较远的优良新种质，是拓展种质基础和创新种质的重要渠道[20]。因此，本研究通过40对SSR分子标记对50份甜玉米自交系分别进行了扩增，并依次利用电泳进行基因分型，然后利用UPGMA方法进行聚类分析，最终将50份甜玉米自交系材料划分为6大类，较好地划分了供试甜玉米自交系的遗传背景。结合聚类划分结果进行优良甜玉米自交系的组合配对实验，发现杂交F1农艺性状都表现良好，说明本研究的甜玉米遗传多样性分析可以快速对实验种质资源进行归类，确定杂交种为基础的自交系与父母本的遗传距离远近，将调控优良性状的基因高效地进行集合，对遗传基础方向的探索和途径的拓展带来极大的帮助。

3.2 SSR标记技术的特点及其存在的问题

前人研究结果表明，群体遗传多样性与PIC值紧密相关，即群体的平均PIC值越高，DNA标记位点变异程度越高，群体的遗传多样性就越丰富[21]，而PIC值的提高可以通过选择更多的均匀分布在各个染色体上的SSR引物来实现[22]。在本研究中，40对SSR核心标记引物均匀地分布在玉米的10条染色体上，在50份甜玉米自交系材料中共检测到228个等位基因变异，不同的SSR标记检测到的等位基因变异为3～13个，平均为5.65个，40对SSR标记引物位点的PIC值变化范围在0.32～0.89，平均为0.59，PIC值较高，可以较好地揭示50份甜玉米自交系的遗传差异。分子标记的出现为遗传多样性分析提供了新的方法。随着玉米基因组学的迅猛发展及分子育种实践的持续深入，SSR标记技术将会得到快速发展与改进[23-25]。SSR标记技术的深入应用，方便了育种者从分子层次上揭示表型性状与基因之间的关系。但是，SSR标记所面临的问题是开发新的SSR引物投入高、难度相对较大并且在构建玉米高密度遗传图谱时需要引入其他的标记技术。但未来随着科学家们对SSR标记技术运用程度的逐步加深，SSR标记技术面临的难题将会被逐一攻破。