米浆水对黑米料酒发酵的影响

梅 璐, 陈 新, 周 悦, 孙汉巨, 徐尚英, 杨 柳

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.安徽海神黄酒集团有限公司,安徽 合肥 231500)

以黄酒为主体酿造的料酒具有营养丰富、增香提味的优点,市场需求量逐年增加。酿造料酒一般通过添加焦糖色素调节产品色泽,而以黑米为原料酿造的酒液颜色较深,降低了焦糖色素的使用量,且黑米料酒中含有多种活性物质,因此深受消费者欢迎[1]。

黑米是黑稻脱去谷壳的糙米,不仅富含碳水化合物、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素和膳食纤维等,还含有大量的花青素、类黄酮、维生素E、胡萝卜素、强心甙、植酸、多酚和γ-谷维素等多种活性物质[2]。料酒酿造过程包括浸米、蒸煮、发酵、压榨、煎酒、贮存等。浸米是酿造的第1步,浸泡过程中大米吸收水分,使淀粉在蒸煮过程中易被糊化,且有利于产酸细菌生长,增加米浆水的酸度。酸化的大米能保证发酵初期不易被杂菌污染,提高原料出酒率和产品品质[3]。在料酒酿造过程中,每吨大米产生约1 m3的米浆水,产量巨大。米浆水中淀粉、有机酸、可溶性蛋白等物质含量高[4],理论上可被用于料酒发酵,但在实际生产应用中,发现将米浆水添加到发酵过程可能会降低料酒过滤速率以及改变产品风味等。米浆水的资源化利用已有一些研究,文献[5]发现经过酸性蛋白酶处理的米浆水上清液回用至发酵过程,酒液过滤速率增加43.48%,并且不会影响黄酒的发酵及黄酒风味;文献[6]发现将生物酸化浸米的米浆水添加20%代替自来水发酵,与自然浸泡发酵的黄酒无明显差别。但上述研究过程中仍存在着大量米浆水被作为废水处理。米浆水具有较高的生化需氧量(biological oxygen demand,BOD)和化学需氧量(chemical oxygen demand,COD),直接排放会污染环境[7]。一般工厂多采用酸化、UASB厌氧、SBR好氧等工艺对米浆水进行治理。

黑米坚硬的外壳包裹着糊粉层,花青素、类黄酮等活性物质存在于糊粉层中,浸泡时物质溶出量较少,不利于米浆水的酸化[8],从而导致发酵效率降低;蒸煮过程中黑米不易被蒸汽穿透而导致蒸汽量消耗量大。

在前期研究中,课题组从料酒发酵醪中筛选得到一株产酸快、不产生物胺且能在米浆水中快速生长的植物乳杆菌F25-4,将其扩大培养后在浸米过程中添加,发现能够减少黑米蒸煮时的蒸汽用量;将其米浆水添加至发酵醪中,对料酒发酵产生有益效果。本文将接菌浸泡的米浆水代替普通酿造用水添加至初始发酵的米醪中,对料酒发酵的影响进行研究,研究结果为米浆水的资源化利用提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)F25-4从安徽海神黄酒集团有限公司的发酵醪中筛选得到,在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.M 20211574。

1.2 材料

黑米由安徽海神黄酒集团有限公司提供;ABTS(分析纯)购于上海源叶生物科技有限公司;浓硫酸、蒽酮、盐酸、茚三酮、香草醛、无水乙醇、酪氨酸(均为分析纯)均购于国药集团化学试剂有限公司;水合茚三酮(99.9%)购于美国Sigma-Aldrich公司;酿酒曲(绍酒风味T3)、安琪酿酒高活性干酵母(黄酒专用)均购于安琪酵母股份有限公司。

1.3 仪器

7890B气相色谱仪(安捷伦科技有限公司);SP-752紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);S-4330D氨基酸分析仪(德国SYKAM公司);SCION-456四极杆气质联用仪(德国布鲁克分析仪器公司);WSF分光测色仪(上海一电公司);pHS-3C pH计(雷磁仪器公司);TA-XTPLUS物性测试仪(英国STABLE公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 黑米料酒发酵

称取5 kg黑米,加入1.5倍质量的自来水(符合生活饮用水标准GB 5749—2006),加入植物乳杆菌F25-4的培养物使菌体菌落浓度为105CFU/mL,37 ℃浸泡48 h,沥去水,黑米置于蒸笼中,通入蒸汽,控制温度为110 ℃,蒸煮15 min。加入7.5 L煮沸并冷却至室温的自来水,待物料冷却至35 ℃左右时转入25 L发酵罐中,加入5 L补料水、活化后的酿酒曲和活性干酵母,搅拌均匀。28～32 ℃发酵5 d并不时搅拌,15 ℃继续发酵15 d。发酵结束后,对发酵醪液进行抽滤,滤液即为原酒液。按加入补料水的不同,实验分2组:对照组为经煮沸的自来水;实验组为经煮沸的米浆水(产生的米浆水共约4.5 L,不足5 L部分用经煮沸的自来水补足)。

1.4.2 测定方法

pH值采用pH计法;氨基酸态氮质量浓度的测定参照GB/T 5009.235—2016;花青素质量浓度测定采用盐酸香草醛法[9];总糖质量浓度采用蒽酮硫酸法[10],以葡萄糖为标准品测标准曲线,具体公式如下：

y=1.618x-0.047 2,R2=0.999。

米浆水中菌落数量的测定。各取1 mL自然浸泡与植物乳杆菌F25-4浸泡48 h的米浆水梯度稀释至106、107,分别涂布于营养琼脂平板和MRS琼脂平板,30 ℃培养48 h,进行计数。

黑米蒸煮特性测定。将浸泡后黑米分别于121、110、105、100 ℃蒸煮15 min,利用TA-XTPLUS物性测试仪对各样品进行物性分析。物性测试程序如下：探头为P36 R、压缩比为90%、速度为0.5 mm/s。

过滤速率的测定。将布氏漏斗与真空泵相连,漏斗中放入中速滤纸,提前打开真空泵,倒入发酵醪的同时进行计时,至抽滤完毕测量滤液体积,计算出每分钟过滤体积，即为过滤速率。

酒精度的测量采用气相色谱法[11];色度采用测色仪对酒液进行测定。

1.4.3 清除率的测定

DPPH自由基清除率方法参考文献[12],并略有修改。取4 mL酒液加入1 mL 1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液,混匀,置于黑暗处反应30 min,于517 nm处测定吸光度值,Vc为阳性对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下:

(1)

其中:A0为DPPH和水的吸光度;A1为样品溶液的吸光度;A2为样品溶液加入 DPPH自由基反应后的吸光度。

ABTS自由基清除率参考文献[13]方法测定,按ABTS试剂盒方法检测。

·OH清除率测定参考文献[14]方法,略有修改。取2 mL黑米料酒于试管中,加入2 mL的9 mmol/L的FeSO4溶液和2 mL的9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,充分混匀后,加入2 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液混匀,37 ℃下反应 30 min,510 nm下测定吸光度值。计算黑米料酒对·OH的清除率,具体公式如下:

(2)

其中:A0′为空白对照的吸光度;A1′为样品溶液的吸光度;A2′为样品溶液加入H2O2溶液反应后的吸光度。

1.4.4 风味及感官评价

游离氨基酸采用氨基酸分析仪,参考文献[15]方法测定。氨基酸风味比值为鲜味氨基酸和甜味氨基酸质量浓度之和与苦味氨基酸和涩味氨基酸质量浓度之和的比值。

挥发性风味物质采用顶空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)，测定发酵样品中挥发性风味物质的质量浓度,测定方法参考文献[15]。

1.4.5 感官评价

由经验丰富的10人组成一个评定小组(5女5男),根据GB/T 13662—2018从外观(红度、浊度)、香气(酒香、果香、花香、谷香)、口感(甜、酸、辣、黏、苦)、口感(涩味、持久性、饱和感)等对样品进行感官特征评价。强度等级为0～5(0无，1代表很弱，2代表普通，3代表温和,4代表强烈,5代表最强烈)。

1.5 数据统计

采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS statistics 22.0、Origin 2019软件进行数据处理分析。所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 米浆水的理化性质

将植物乳杆菌F25-4培养物添加至浸米罐中,对照组为未人工接种的自然浸泡,37 ℃下浸米48 h。2组米浆水的理化性质见表1所列。

从表1可以看出，接菌组米浆水中的氨基酸态氮为1.690 mg/mL,较对照组增加60.80%;花青素和总糖的质量浓度比对照组分别降低了12.14%和26.54%;接菌组米浆水的pH值为4.36,显著低于对照组。实验结果表明,菌株F25-4能利用水浆水中营养成分迅速生长,并产生有机酸,降低了体系pH值。接菌组米浆水中,不仅有接入的菌株F25-4细胞,还含有环境中微生物,接菌组的微生物细胞数量高于对照组,随着酸度增大,不耐酸的微生物会自溶死亡,释放出菌体的氨基氮,导致实验组氨基酸态氮增加[16]。接菌组米浆水中总糖、花青素质量浓度降低,可能是由于在酸性环境下,黑米溶出物减少。

表1 米浆水的理化性质

2.2 蒸煮特性比较

将浸泡后黑米分别在不同温度下蒸煮15 min,利用物性仪测定各样品的硬度、黏度和口感均衡性,对照组为自然浸泡黑米在121 ℃蒸煮15 min,结果如图1所示。图1中,对照组为浸泡黑米121 ℃蒸煮15 min;F121、F110、F105、F100组为加菌浸泡黑米于121、110、105、100 ℃蒸煮15 min 。

由图1可知,接菌浸泡后黑米在110 ℃蒸煮时,米的硬度、黏度以及口感均衡性与对照组没有显著差异。蒸煮温度若过高则米饭呈糊状,若过低则淀粉不能完全糊化,不利于淀粉的糖化。文献[17]发现黑米外皮层影响米粒淀粉的膨胀溶出,蒸煮时间随着碾减率的增加而减小。接菌浸泡后,黑米酸度增加,可能软化或部分分解纤维素、细胞壁组织,有利于淀粉粒的膨胀和溶出,改善米粒的黏弹性,降低黑米的蒸煮温度,减少蒸汽用量。

组别图1 蒸煮温度对黑米物性的影响

2.3 米浆水对料酒过滤速率的影响

米浆水中含有淀粉颗粒、蛋白质、脂肪及灰分等,其作为投料水进行发酵会降低料酒的压榨速率[18]。植物乳杆菌浸泡的米浆水中含有大量乳酸,其米浆水中总酸质量浓度高于自然浸泡的米浆水。添加不同米浆水对料酒抽滤速率的影响见表2所列。 表2中,对照组为自然浸泡添加自来水发酵;对照补料组为自然浸泡添加米浆水发酵;F组为接菌浸泡添加自来水发酵;F补料组为接菌浸泡添加米浆水浸泡。

由表2可知,添加米浆水后,对照补料组过滤速率与对照组相比略有降低,可能是米浆水中的蛋白质和淀粉具有很强的吸水性和保水性,这使得抽滤过程中抽滤速率减慢,降低了出酒率[5]。接菌浸泡的米浆水能提高酒醪的过滤速率。前期的米浆水冻干物聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(数据未显示)发现接菌浸泡的米浆水中的蛋白质含量增加,但相对分子量降低,淀粉含量减少,从而降低了蛋白质与淀粉的吸水率,提高了酒醪的过滤速率。

表2 米浆水对黑米料酒过滤速率的影响 单位:mL/min

2.4 米浆水对黑米料酒发酵的影响

米浆水中含有一定量的营养物质,其作为投料水进入发酵对料酒的酒精度、花青素、氨基酸态氮以及总糖质量浓度的影响见表3所列。

从表3可以看出,米浆水的添加对酒精度、花青素以及总糖质量浓度影响不显著,但氨基酸态氮质量浓度显著增加,酒液色泽变化明显。添加米浆水的料酒酒液氨基酸态氮的质量浓度为191.535 mg/L,较对照组提高 14.46%。料酒中氨基酸态氮质量浓度适当提高有利于酒的醇厚性。加入米浆水发酵的料酒的亮度、红色、蓝色色泽都高于对照组,即黑米酒的亮度、红色和黄色色泽都增加,但红色色泽显著增加(P<0.05),红色主要来源于花青素[19]。说明米浆水的添加可改善黑米料酒的部分颜色指标,提高酒中花青素的质量浓度。

表3 米浆水对黑米料酒理化性质的影响

2.5 黑米料酒抗氧化活性的变化

黑米米浆水含有大量花青素,花青素属于黄酮类物质,具有自由基清除能力和抗氧化能力。通过DPPH、ABTS和·OH自由基清除率来测定米浆水对料酒抗氧化活性的影响，结果如图2所示。

组别图2 米浆水对黑米料酒抗氧化活性的影响

由图2可知,米浆水的添加能显著提高酒液的抗氧化活性，其中米浆水组中DPPH、ABTS、·OH自由基清除率分别为64.96%、40.23%、37.11%,较对照组分别增加39.11%、20.80%、19.40%。抗氧化活性与花青素、总酚、总黄酮等有关,文献[20]报道自由基清除活性与花青素含量成正比。黑米浸泡过程中,花青素溶出进入米浆水中,抗氧化活性随着米浆水添加而升高。

2.6 黑米料酒氨基酸质量浓度的变化

氨基酸是重要的呈味物质,料酒中氨基酸主要来自于原料中蛋白质的分解及酵母、霉菌等微生物自溶,其含量、种类与料酒的质量和风味有密切关系[21]。向蒸煮后的米添加100%米浆水作为投料用水进行发酵,利用氨基酸分析仪测定黑米料酒原酒液中游离氨基酸的种类和质量浓度,并与未添加米浆水的料酒(对照组)比较,结果见表4所列。

表4 米浆水对黑米料酒游离氨基酸的影响

由表4可知,黑米料酒中共检测到15种氨基酸,含有苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸7种必需氨基酸。氨基酸不仅赋予了料酒丰富的营养价值,而且具有良好的呈味作用,例如丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等呈甜味;组氨酸、精氨酸等呈苦味;酪氨酸呈涩味;天冬氨酸、谷氨酸呈鲜味[22]。与对照组相比,添加米浆水制备的料酒氨基酸质量浓度显著增加,其中甜味氨基酸增加10.26%,丝氨酸、苏氨酸贡献最多,并且氨基酸风味比值较对照组增加10.74%,达到80.4%。料酒酒液总氨基酸质量浓度较对照组增加10.26%。说明添加米浆水有利于料酒中氨基酸质量浓度提升和料酒风味改善。

2.7 黑米料酒挥发性风味物质

风味物质是料酒品质的重要指标之一,而挥发性物质是影响料酒风味的关键因素。料酒中香气成分主要来源于酿造原料、酒曲中微生物代谢物及陈酿过程中物质的转化, 同时料酒中不同物质之间存在相互作用, 使得香气成分的组成更加复杂[23]。米浆水添加对料酒中挥发性风味物质种类和质量浓度的影响见表5所列。

表5 米浆水对黑米料酒挥发性风味物质的影响

由表5可知,米浆水组料酒中检测到2种挥发性风味物质,总挥发性风味物质质量浓度为92.543 mg/L,较对照组增加10.53%,其主要的风味成分为醇类、酯类和酸类,质量浓度分别为70.891、11.212、8.837 mg/L。醇类赋予黑米料酒特有的醇香、丰满圆润的口感[24],醇类中质量浓度较高的为β-苯乙醇、十二醇、异戊醇,β-苯乙醇是料酒中重要的芳香化合物,赋予料酒柔和、优雅的玫瑰香气,提高β-苯乙醇质量浓度有利于提升料酒风味。米浆水添加对β-苯乙醇质量浓度影响较大,随米浆水增加而增加[25]。异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣味,是酒中产生上头感主要成分之一。酯类是酵母将有机酸与醇类通过酶的催化形成的[26],酯类中辛酸乙酯具有白兰地气味,由辛酸和乙醇反应生成,乙酸苯乙酯具有浓烈的蜜样花香以及水果香。酸类物质中己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸呈不适气味,棕榈酸无味,除棕榈酸外,米浆水添加引起料酒中酸类物质质量浓度略有降低。4-乙烯基苯酚具有甜香和香荚兰豆萃取物的香气,十一烯醛有强烈的玫瑰、柑橘型香气,对酒体风味产生较好效应。

2.8 感官评价分析

料酒的风味是许多组分相互作用、相互平衡的结果,添加米浆水对黑米料酒的感官品质的影响如图3所示。

图3 米浆水对黑米料酒感官评价的影响

由图3可知,添加米浆水发酵的产品在浓郁度、持久性、红色度、酒香和果香等特性方面明显高于对照组,但酸度、苦味以及辣味较低,这可能是由于料酒中甜味和鲜味氨基酸与风味物质共同作用的结果,较多的酸类和苦味氨基酸可能影响黑米料酒呈味品质。添加米浆水制备的黑米料酒中持久性、酒香以及红色度得分最高,这可能与黑米料酒中含有的风味物质种类以及高级醇质量浓度有关,色泽与花青素质量浓度有关。

3 讨 论

随着酿造料酒产业不断发展,生产过程中产生的米浆水、酒糟及加工废水等环境问题受到广泛关注。米浆水是酿造料酒行业的主要副产物,含有大量有机物、多种微生物及其代谢物。在春、秋两季浸米,米浆水常含有产生不良气味的芽孢杆菌,常表现为“白花”和异嗅味[27]。这种米浆水直接用于发酵不仅给料酒带来不良风味,还会降低酒醪的过滤速率。在浸米过程中接种性能优良的植物乳杆菌F25-4,该菌株在米浆水中能够快速生长并产生乳酸,抑制杂菌生长,降低米浆水中的生物胺含量;米浆水酸度的增加导致黑米的蒸煮温度降低,有利于生产企业的节能降耗。米浆水中的蛋白质与淀粉影响酒液压榨速率,接菌浸泡后的米浆水中淀粉质量浓度与可溶蛋白平均分子量均明显降低,更利于被微生物利用,提高黑米酒醪的过滤速率。此外,米浆水可以有效提高料酒中氨基酸态氮、花青素的质量浓度,促进料酒挥发性风味物质的产生,提高酒液的抗氧化活性以及色泽。但对料酒中的风味物质种类及其质量浓度等影响还需进一步探究。通过接种性能优良的乳酸菌进行浸米,将产生的米浆水用于料酒发酵,能解决米浆水的污染问题,是一种简单易行的料酒绿色酿造技术,具有广阔的应用前景。