UPLC-MS/MS 检测小儿咳喘灵颗粒中4 种黄曲霉毒素及灰毡毛忍冬皂苷乙

石慧君，张文丽

九江市检验检测认证中心，江西 九江 332000

小儿咳喘灵颗粒是由麻黄等七味中药制得，适用于缓解感冒、喘症等［1-2］。现行标准为卫生部药品标准中药成方制剂第四册及20 个注册标准，具体包括金银花或甘草酸铵的薄层色谱鉴别、绿原酸或盐酸麻黄碱的高效液相色谱含量测定等项目［3］，尚未从安全性和非法添加方面进行全面的质量控制。处方中苦杏仁为富含淀粉、油脂的种子类药材，瓜蒌、甘草等药材在加工、贮藏及运输过程中易发生霉变，根据2020 年版《中国药典》中药中真菌毒素测定指导原则规定，粮谷类、种子类、油性成分多的品种应注意黄曲霉毒素的检测以及处方中含有易污染药材的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测［4］，故有必要研究该中成药中黄曲霉毒素的安全性。但目前未见小儿咳喘灵颗粒中黄曲霉毒素测定相关研究，而且应用较为广泛的相关检测方法为柱后光化学衍生HPLC 法［5-7］。另外虽已有不少文献涉及金银花非法掺伪山银花，但是基本采用薄层定性鉴别和HPLC-ELSD 法定量确认［8-9］。随着技术手段不断更进，液相色谱－质谱联用技术因具高通量、色谱无需完全分离及能够解决假阳性等特点，越来越多应用在定性筛查及定量方面。2019 年有文献［10］报道采用UPLC-MS/MS 检测小儿咳喘灵颗粒样品中掺伪山银花的特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙，需先进行HPLC-ELSD 法筛查及定量，阳性样品再用UPLC-MS/MS 法定性确证是否掺杂山银花。为了检验检测手段更加快速、便捷，本研究结合实验室具体仪器及实际应用，建立了UPLC-MS/MS 法（MRM模式下）对小儿咳喘灵颗粒中4 种黄曲霉毒素及灰毡毛忍冬皂苷乙的定性定量分析，找到响应值高的监测离子对和最优仪器参数条件，以期为小儿咳喘灵颗粒检验标准提升做参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Xevo-TQD 串联四级杆液质联用仪（美国Waters 公司，ACQUITY 系统，MassLynxV4.1 工作站，ESI 离子源）；离心机（上海Anke 仪器厂）；Sartorius BP211D 天平（Sartorius 公司）；Sartorius BSA 124s 天平（Sartorius 公司）。

1.2 试药

黄曲霉毒素Mix-4 标准品溶液［中国食品药品检定研究院，黄曲霉毒素B1（AFB1）0.93 μg/mL、黄曲霉毒素B2（AFB2）0.30 μg/mL、黄曲霉毒素G1（AFG1）0.93 μg/mL、黄曲霉毒素G2（AFG2）0.35 μg/mL，批号610001-201804］；灰毡毛忍冬皂苷乙标准品（中国食品药品检定研究院，批号111814-201604，含量以94.4%计）。甲醇和乙腈为质谱级（德国默克公司）；水为屈臣氏饮用水；甲酸为色谱纯。小儿咳喘灵颗粒样品为18 个生产企业的51 个批次。

2 黄曲霉毒素的含量测定

2.1 溶液配制

2.1.1 黄曲霉毒素Mix-4 储备溶液的制备精密吸取黄曲霉毒素Mix-4 标准品溶液500 μL，加70%甲醇制得每1 mL 含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别为46.50 ng、15.00 ng、46.50 ng、17.50 ng 的混合储备溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取小儿咳喘灵颗粒约6 g，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液50 mL，高速搅拌2 min，离心5 min，精密量取上清液25 mL，置于50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，精密移取续滤液20 mL 于免疫亲和柱中，用水20 mL 洗脱，弃去洗脱液，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置于2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 空白基质溶液的制备取不含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的小儿咳喘灵颗粒样品，依照“2.1.2”项下制备方法制得。

2.2 色谱-质谱条件

色谱柱为UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）。梯度洗脱程序为0～1 min，20%A；1～4 min，20%→40%A；4～5 min，40%A；5～6.8 min，40%A→100%A；6.8～7.0 min，100%A→20%A；7.0～9.0 min，20%A。流速为0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。ESI+离子源模式；离子源参数：毛细管电压3.0 kV；锥孔电压20 V；脱溶剂气温度620 ℃；脱溶剂气流量800 L/h；锥孔反吹气流量：50 L/h；离子源温度：150 ℃；MS/MS 操作模式为多反应监测（MRM）模式。用于定性、定量的离子对和相关质谱参数如表1 所示。

表1 黄曲霉毒素（AF）B1、B2、G1、G2的质谱参数

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察基质标准溶液、供试品溶液及空白基质溶液的MRM 图见图1，结果显示，基质标准溶液呈现黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2色谱峰，且空白基质溶液无干扰。

图1 4种黄曲霉毒素MRM图：A.基质标准溶液；B.供试品溶液；C.空白基质溶液

2.3.2 线性关系考察将上述对照品储备液分别精密吸取20 μL 于5 mL 容量瓶中及40、160、240、320、400 μL 于2 mL 容量瓶中，用“2.1.3”项下的空白基质溶液以配制基质标准系列溶液，分别进样分析。以定量离子对的谱峰峰面积（Y）与对照品浓度（X）进行线性回归得出回归方程，3 倍、10倍信噪比值时得出的是检出限和定量限，结果可知在各浓度范围内检测相关系数良好，见表2。

表2 4种黄曲霉毒素线性关系及检出限、定量限 ng/mL

2.3.3 回收率考察选取未检出黄曲霉毒素的小儿咳喘灵颗粒为空白样品，精密添加“2.1.1”项下标准品溶液高、中、低3 个不同水平（1 mL、0.5 mL、0.25 mL），每个水平各3 份，按“2.1.2”项下步骤制备加样待测溶液，分别计算添加回收率，结果见表3。

表3 样品中黄曲霉毒素添加回收率测定结果

2.3.4 精密度考察取“2.3.3”项下制备的中水平加样待测溶液1 份，在“2.2”项条件下连续进样6 次测定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的峰面积，计算精密度RSD 分别为1.0%、2.7%、3.1%、3.4%。

2.3.5 重复性考察平行制备六份“2.3.3”项下中水平加样待测溶液，在“2.2”项条件下进样测定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的平均含量，计算重复性RSD 值分别为0.9%、1.5%、2.0%、2.2%。

2.3.6 稳定性考察取“2.3.3”项下中水平加样待测溶液1 份，分别在0，2，4，8，12，24 h 进行测定，计算其稳定性RSD 值为1.5%、1.7%、2.0%、2.5%。

2.4 样品测定

按照建立的方法检测18 个厂家51 批小儿咳喘灵颗粒中4 种黄曲霉毒素，结果表明51 批小儿咳喘灵颗粒样品中4 种黄曲霉毒素均在检出限以下。

3 灰毡毛忍冬皂苷乙的含量测定

3.1 溶液配制

3.1.1 标准储备溶液的制备精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙标准品8.83 mg，置100 mL 量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，即得灰毡毛忍冬皂苷乙储备液。

3.1.2 供试品溶液的制备取小儿咳喘灵颗粒约2 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 mL，称定重量，超声处理30 分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL 到10 mL 容量瓶中加75%甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。

3.1.3 空白基质溶液的制备取不含灰毡毛忍冬皂苷乙的小儿咳喘灵颗粒样品，依照“3.1.2”项下制备方法制得。

3.2 色谱-质谱条件

色谱柱为UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）。梯度洗脱程序为0～0.3 min，5%A；0.3～7 min，5% →95%A；7～8 min，95%A；8～8.1 min，95%→5%A；8.1～10 min，5%A。流速为0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 μL。ESI-离子源模式；离子源参数：毛细管电压：2.8 kV；锥孔电压：65 V；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/hr；锥孔反吹气流量：50 L/hr；离子源温度：150 ℃；MS/MS 操作模式为多反应监测（MRM）模式。定量离子对1 397.8＞1 074.36，锥孔电压值65 V，碰撞能设47 V；定性离子对1 397.8＞536.44，锥孔电压值65 V，碰撞能设55 V。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性考察基质标准溶液、供试品溶液及空白基质液的MRM 图见图2，结果显示，基质标准溶液与供试品色谱呈相同保留时间的灰毡毛忍冬皂苷乙色谱峰，且空白基质液无干扰。

图2 灰毡毛忍冬皂苷乙MRM图：A.基质标准溶液；B.供试品溶液；C.空白基质溶液

3.3.2 线性关系考察精密吸取“3.1.1”项下标准储备液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用“2.1.3”项下的空白基质溶液配制成833.552 ng/mL 的基质标准溶液，依次进样0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，注入液质联用仪。以定量离子对的谱峰峰面积（Y）和对照品进样量（X）进行线性回归，得到回归方程为Y=0.817 72X-5.190 52，相关系数r=0.999 0，说明在0.083～2.501 ng 范围内线性关系良好；将标准品溶液逐级稀释，当信噪比（S/N）为3 时，确定灰毡毛忍冬皂苷乙的检测限为0.556 ng/mL。

3.3.3 回收率考察精密称取1 g 检出灰毡毛忍冬皂苷乙的供试品共9 份，置锥形瓶中，分别精密添加“3.1.1”项下标准品溶液低、中、高3 个不同水平（0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL），每个水平各3 份，依照“3.1.2”项下方法操作，计算添加回收率，结果见表4。

表4 样品中灰毡毛忍冬皂苷乙添加回收率测定结果

3.3.4 精密度考察取“3.3.3”项下配制成的中水平加样待测溶液，在“3.2”项条件下连续测定6 次灰毡毛忍冬皂苷乙的峰面积，计算精密度RSD 值为3.9% 。

3.3.5 重复性考察选取“3.3.3”项下同一批号的供试样品，平行制备6 份供试品溶液，在“3.2”项条件下进样测定灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量，计算重复性RSD 值为3.1%。

3.3.6 稳定性考察取“3.3.3”项下同一批号的供试样品1 份，分别在0，2，4，8，12，24 h 进行测定，计算其稳定性RSD 值7.8%。

3.4 样品测定

取18 个厂家51 批小儿咳喘灵颗粒的样品溶液进行分析。结果3 批样品检出灰毡毛忍冬皂苷乙，检出含量分别为0.068 55 mg/g、1.013 mg/g、0.288 5 mg/g。

4 讨论

4.1 净化条件的优化

小儿咳喘灵颗粒成分复杂，产生的基质效应是影响UPLC-MS/MS 检测准确度的主要因素，本研究采用免疫亲和柱对样品进行纯化，有效去除基质中大量辅料及醇不溶性杂质，回收率结果令人满意，操作简便。

4.2 UPLC-MS/MS 仪器参数的优化

4.2.1 测定黄曲霉毒素比较乙腈/甲醇-甲酸溶液、甲醇/乙腈-醋酸铵溶液等不同系统流动相，其中乙腈系统峰形及分离度较好，保留时间较短，更能实现快速分析。流动相水相加入甲酸时，正离子模式的4 种黄曲霉毒素离子响应强度很好；当加入醋酸铵时，响应值较之更低。也考察了甲酸的浓度0.1%、0.2%、0.3%，其中0.2%的甲酸浓度色谱峰型效果和离子化效果最佳，故选择乙腈-0.2%甲酸溶液作为流动相测定4 种黄曲霉毒素。配制黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的标准品，在调谐（mass tune）界面中，选正离子MS 模式根据母离子响应强度优化毛细管电压、锥孔电压和脱溶剂气温度等，打开碰撞气氩气，MS/MS 模式下做子离子扫描（daughter scan）采集。确定定量和定性子离子，设定好母离子和碎片离子，通过优化碰撞能，使子离子响应强度最高。

4.2.2 测定灰毡毛忍冬皂苷乙结合文献资料［10-11］，ESI 正离子源模式下，离子对1 421.6＞1 097.5，确定［M+Na］+。通过MS SCAN 模式扫描，不能提取到1 421.6 的母离子，下一步手动调谐寻找母离子，选择不同毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气温度，最终确定正离子模式下最优条件：毛细管电压：3.2 kV；锥孔电压：53 V；脱溶剂气温度：450 ℃；离子源温度：150 ℃，此时m/z 1 421.6 离子响应值最大。打开碰撞气氩气，做daughter scan 采集提取到子离子936.08 和1 097.64，然而设定好母离子和碎片离子，通过优化碰撞能，并不能在质谱观测窗口看到任何采集图谱。于是建立了ESI-模式下的UPLC-MS/MS 法，按照手动调谐步骤，重复上述操作，优化条件得到毛细管电压：2.8 kV；锥孔电压：65 V；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/hr；锥孔反吹气流量：50 L/hr；离子源温度：150 ℃。确定m/z 1 397.8 离子响应强度最大，对应母离子［M-H］-，继续优化碰撞能，得到子离子1 074.36（离子响应最高）和536.44（响应次之）。实验中采用MRM 监测模式定性定量，所建立的方法专属性强，结果准确可靠，可用于准确筛查小儿咳喘灵颗粒中山银花的使用情况。

4.3 含量测定结果分析

建立的免疫亲和柱净化UPLC-MS/MS 法检测4种黄曲霉毒素，样品中均未检出，说明小儿咳喘灵颗粒均无黄曲霉毒素污染察，质量安全性良好。建立的UPLC-MS/MS 快速测定样品中灰毡毛忍冬皂苷乙，检出3 批存在掺杂山银花违规现象，因此应加强中药制剂中对山银花代替金银花投料的监管，严防非法添加山银花的现象发生。

该研究从质量安全和非法添加出发，实现了建立UPLC-MS/MS 方法定性定量分析小儿咳喘灵颗粒中4 种黄曲霉毒素及灰毡毛忍冬皂苷乙，能够快速、有效地对小儿咳喘灵颗粒进行质量把控。