6种杀菌剂对食用菌链孢霉的体外抑制作用

刘斌， 董照锋

(1.陕西省农产品质量安全中心，陕西 西安 710000； 2.商洛市农产品质量安全中心，陕西 商洛 726000)

食用菌以味道鲜美、营养丰富而逐渐成为人们餐桌上常见的健康食品。近年来，随着我国农业产业结构的调整，食用菌在现代农业生产中的地位和作用越来越明显。随着国家环保政策调整和栽培方式的转变，食用菌产业步入了规模化、工厂化、设施化、标准化的发展轨道。但链孢霉在很多香菇、木耳等食用菌生产基地发生，其生长速度快，生活力强，如果处理不及时几天内就能引起大面积污染，调查中最高污染率达75%，造成重大的经济损失。国内有不少学者开展了抑制食用菌链孢霉的相关研究。赵长江等[1]采用药剂平板法分析了5种植物源农药对食用菌链孢霉的抑制效果，筛选出乙蒜素和丁子香酚作为其绿色防控的优选植物源农药。张希等[2]采用平板涂布法考察了15种中药材提取物对3种食用菌致病菌孢子萌发的影响，认为大蒜、徐长卿、小蓟、金银花、黄柏、土荆皮、石榴皮对链孢霉孢子萌发有较好的抑制作用。叶慧丽等[3]测定了4种生物杀菌剂对食用菌链孢霉的抑制作用，40 mg·kg-1中生菌素对链孢霉菌丝生长抑制率达到100%，而对食用菌菌丝抑制率低于10%。刘钊等[4]开展了6种杀菌剂对链孢霉的抑菌效果试验，认为100倍克霉灵和链孢克星对链孢霉抑菌作用较好。冀瑞卿等[5]采用生长速率法和悬滴法测定了多黏类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对食用菌链孢霉菌丝和孢子的抑制效果，认为两种生防制剂可分别作为链孢霉孢子和菌丝的抑制剂。李宁芳等[6]采用对比试验分析食用菌链孢霉感染的原因，提出了精准预防、过程控制的一般污染和严重污染的控制对策。朱富春[7]提出了树立防治意识、推选优质菌种、搞好环境卫生、严格栽培操作、合理化学防治的综合措施以防控食用菌链孢霉的为害。贾含琪[8]从土壤中筛选出一株对链孢霉有良好抑制作用的真菌，将其90%乙醇洗脱物稀释成有效浓度为45%的制剂，用量为400 μL·mL-1时可有效抑制危害。为了筛选安全高效的防治药剂，本研究选取微生物源农药、抗生素类农药和化学农药3大类6种药剂开展食用菌链孢霉的体外抑制试验，同时考察其对食用菌菌丝生长的影响，以期为食用菌生产中链孢霉的化学防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

430 g·L-1戊唑醇悬浮剂(盐城利民农化有限公司)；100亿芽孢·g-1枯草芽孢杆菌粉剂(陕西鼎微生物科技有限公司)；0.15%四霉素水剂(辽宁微科生物工程股份有限公司)；2%春雷霉素水剂、3%多抗霉素水剂(绩溪农华生物科技有限公司)；40%多菌灵悬浮剂(江苏剑牌农化股份有限公司)；0.05 mol·L-1HCl(国药集团化学试剂有限公司)。

供试菌株于2020年春季在商洛市福众岭农业有限责任公司香菇基地采集，经实验室分离鉴定，连续纯化两代后接种在PDA试管斜面培养基，并置于4 ℃保存备用。

1.2 处理设计

试验设7个处理，每个处理3次重复，每种杀菌剂的试验浓度参考使用说明推荐用量。A：430 g·L-1戊唑醇悬浮剂90 μg·mL-1；B：100亿芽孢·g-1枯草芽孢杆菌粉剂500万芽孢·mL-1；C：0.15%四霉素水剂 2.0 μg·mL-1；D：2%春雷霉素水剂100 μg·mL-1；E：3%多抗霉素水剂60 μg·mL-1；F：40%多菌灵悬浮剂 1 000 μg·mL-1；CK：清水对照。

1.3 试验方法

采用菌丝生长速率法[9-10]和孢子萌发法[11-12]分别测定6种供试药剂对菌丝生长和孢子萌发的抑制效果。

含药培养基的制备及菌丝接种：将马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基定量分装于100 mL三角瓶中，121 ℃灭菌40 min，水浴锅冷却至50 ℃，分别加入6种供试药剂，充分混合均匀后取10 mL注入灭菌的9 cm培养皿中制成试验浓度的药剂平板，以等量无菌水培养基作空白对照。在PDA培养基活化菌株的菌落生长旺盛处用打孔器取直径6 mm的菌碟，每皿平板培养基放入1块菌碟至中心位置，置于25 ℃、90%相对湿度下培养，分别于20、24 h用十字交叉法测量各皿菌落直径，计算菌丝生长拟制率。菌丝生长拟制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)÷(对照菌落直径-菌碟直径)]×100%。

孢子悬浮液的制备及接种：50 mL无菌水加入0.05 mol·L-1HCl 2 mL备用。选取培养2～3 d已产生分生孢子的平板1～2皿，在无菌条件下加入10 mL上述制备液体，用接种铲轻刮菌落表面，在已灭菌的口径7 cm漏斗上加1层擦镜纸，将孢子悬浮液过滤在已灭菌的50 mL锥形瓶内，并加灭菌的棉塞。取1～2滴孢子悬浮液在显微镜下观察孢子量，以加入适量灭菌水调节孢子浓度至每个视野80～100个孢子为宜。在药剂平板培养皿背面用记号笔画3个小圈标记孢子悬浮液滴入点位置以便观察，3个点呈三角形排列，每点滴1滴孢子悬浮液。以等量无菌水培养基作空白对照。将各处理置于25 ℃、90%相对湿度下培养6～8 h，在对照组孢子萌发80%～90%时将对应处理组全部取出放入4 ℃冰箱冷藏，终止孢子继续萌发并逐一镜检，统计各处理孢子萌发情况。

孢子萌发率=(孢子萌发数量÷观察孢子数量)×100%；孢子萌发抑制率=[(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)÷对照孢子萌发率]×100%。

2 结果与分析

2.1 6种药剂对菌丝生长的抑制作用

6种供试杀菌剂对食用菌链孢霉菌丝抑制率均在60%以上，具有较好的抑菌作用(表1、图1)。其中，处理F和A抑菌作用较好，20 h抑制率分别为95.5%和90.3%，24 h抑制率分别为95.6%和91.5%，24 h较20 h的抑制率略有增加。处理B、C、D、E在20 h时的抑制率分别为73.9%、79.5%、62.6%和63.5%，24 h时抑制率分别为72.0%、81.4%、62.3%和60.6%。20 h和24 h处理F和处理A之间、处理D和处理E之间差异不显著。处理C和处理B于20 h差异不显著，与其他处理之间差异显著。24 h时所有处理之间差异均极显著。

表1 6种杀菌剂对菌丝的抑制作用

图1 6种杀菌剂对食用菌链孢霉菌丝24 h抑制效果

2.2 6种药剂对分生孢子的抑制作用

接种后8 h观察孢子萌发情况，CK萌发率达到75.1%，处理A、C和F抑制率分别为100%、99.9%和71.5%(表2)，处理A与处理C差异不显著，而与处理F差异显著。其他处理对孢子萌发的抑制作用较差，与CK无显著差异。

表2 6种杀菌剂对分生孢子的抑制作用

3 小结与讨论

因四霉素外其他5种供试农药是《绿色食品 农药使用准则》[13]推荐使用的农药，所以本研究未考察6种杀菌剂对食用菌菌丝的安全性。在2021年12月下旬的栽培试验中，我们通过栽培基质加标的方法考察了供试农药对木耳菌丝生长的影响，截至2022年3月20日菌包发菌结束，供试农药并未对菌丝产生明显的影响。在选用食用菌杀菌剂时，应尽量选择对孢子萌发抑制作用强，而对菌丝抑制率较低的药剂。

供试6种杀菌剂对食用菌链孢霉菌丝皆有抑制效果，40%多菌灵悬浮剂 1 000 μg·mL-1和430 g·L-1戊唑醇悬浮剂 90 μg·mL-1对链孢霉菌丝抑制效果显著，其次是0.15%四霉素水剂 2.0 μg·mL-1和100亿芽孢·g-1枯草芽孢杆菌粉剂 500万芽孢·mL-1，2%春雷霉素水剂 100 μg·mL-1和3%多抗霉素水剂 60 μg·mL-1的抑制率也达到60%以上。430 g·L-1戊唑醇悬浮剂 90 μg·mL-1、0.15%四霉素水剂 2.0 μg·mL-1、40%多菌灵悬浮剂 1 000 μg·mL-1对链孢霉分生孢子具有较好的抑制作用，接种后8 h 430 g·L-1戊唑醇悬浮剂 90 μg·mL-1处理的分生孢子无一萌发，0.15%四霉素水剂 2.0 μg·mL-1的抑制率高达99.9%，40%多菌灵悬浮剂 1 000 μg·mL-1的抑制率达到71.5%。综上所述，食用菌链孢霉宜选用戊唑醇、多菌灵和四霉素进行防治，浓度参考推荐使用量。