气相色谱-质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中氯丙醇酯和缩水甘油酯

王雪婷，胡国绅，朱一鸣，沈伟健，丁涛，高玲，刘芸

(南京海关动植物与食品检测中心，南京 210019)

氯丙醇酯和缩水甘油酯是植物油精炼过程中产生的新型污染物[1-7]，国际癌症研究机构已将3-氯丙醇酯的水解产物3-氯丙醇和缩水甘油酯分别定义为人类2B类和人类2A类致癌物。由于棕榈油、大豆油等精炼植物油在婴幼儿配方乳粉中的广泛使用，导致婴幼儿配方乳粉中也存在一定程度的氯丙醇酯及缩水甘油酯污染。欧盟、中国台湾先后对婴幼儿配方乳粉中3-氯丙醇酯和缩水甘油酯进行了设限，但目前我国尚未建立相关限量标准。婴幼儿配方乳粉基质复杂，氯丙醇酯和缩水甘油酯在其中的含量较低，因此建立准确可靠的检测方法显得尤为重要。

目前，食品中氯丙醇酯和缩水甘油酯的分析前样品处理主要有索氏萃取法、超声萃取法、加速溶剂萃取法[8]等，测定方法主要有液相色谱-质谱联用法[9-11](直接法)和气相色谱-质谱联用法[12-20](间接法)，其中间接法只需一种单一的酯类标准品就可测得氯丙醇酯及缩水甘油酯总量，因而更适合于日常检测。已发布的标准GB 5009.191—2016(第三法)和SN/T 5220—2019 均采用碱性酯交换间接法，此法具有反应时间快、检验周期短的特点，但由于在碱性介质中3-氯丙醇，2-氯丙醇和3-溴丙醇很容易发生副反应生成游离态的缩水甘油，样品中3-氯丙醇酯，2-氯丙醇酯和缩水甘油酯的测定结果往往偏低[21-23]。

笔者在样品制备过程中采用酸性酯交换反应，有效避免了副反应的发生，通过优化样品提取条件、仪器分析条件，建立了一种前处理简单、重复性好，结果准确，适用于婴幼儿乳粉中氯丙醇酯和缩水甘油酯分析方法，该法可更好地满足实验室日常检测需要。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪：Aglient 7890B-5977A型，安捷伦科技(中国)有限公司。

快速溶剂萃取仪：Dionex ASE 350 型，美国赛默飞世尔科技公司。

超声波振荡器：KH-500SP 型，昆山禾创超声仪器有限公司。

恒温水浴摇床：BS-06 型，韩国jeiotech 公司。

电子分析天平：(1)SQP Quintix224-1CN 型，感量为1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；(2)MSE125P-1CE-DU 型，感量为0.01 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

涡旋混合器：WH-3 型，上海沪西分析仪器厂。氮吹仪：Auto Vap S60 型，美国ATR 公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准品：纯度(质量分数)为99.6%，英国LGC 公司。

D5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准品、2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准品：纯度(质量分数)均为98%，加拿大TRC 公司。

D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准品：纯度(质量分数)为98.2%，北京曼哈格生物科技有限公司。

棕榈酸缩水甘油酯标准品：纯度(质量分数)为98.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

D5-棕榈酸缩水甘油酯标准品：纯度(质量分数)96%，加拿大TRC 公司。

正己烷、丙酮、甲醇、四氢呋喃、甲苯：色谱纯，美国飞世尔科技公司。

溴化钠、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

苯基硼酸：纯度(质量分数)为97%，上海源叶生物科技有限公司。

婴幼儿配方乳粉样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 快速溶剂萃取仪

萃取试剂：正己烷；萃取温度：100 ℃；萃取时间：8 min；循环萃取次数：2 次。

1.2.2 气相色谱仪

色谱柱：DB-5MS 型毛细管柱(30 m×0.25 mm，1 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱升温程序：初始温度为80 ℃，保持0.5 min，然后以20 ℃/min的速率升至180 ℃，保持0.5 min，再以5 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持4 min，最后以40 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持4 min；载气：氦气，流量为1.0 mL/min；进样方式：不分流进样；进样口温度：280℃；进样体积：1.0 μL。

1.2.3 质谱仪

质谱接口温度：300 ℃；离子源温度：280 ℃；离子化方式：EI；离子化能量：70 eV；测定方式：选择离子扫描模式；溶剂延迟：6 min；6 种衍生物的质谱参数见表1。

表1 6 种衍生物的质谱参数

1.3 标准溶液配制

3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准储备液：1 mg/mL(以3-氯丙醇计)，准确称取3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准品53.14 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准储备液：1 mg/mL(以2-氯丙醇计)，准确称取2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准品58.21 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

棕榈酸缩水甘油酯标准储备液：1 mg/mL(以缩水甘油计)，准确称取棕榈酸缩水甘油酯标准品42.18 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

D5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准储备液：1 mg/mL(以D5-3-氯丙醇计)，准确称取D5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯标准品51.27 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准储备液：1 mg/mL(以D5-2-氯丙醇计)，准确称取D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯标准品56.13 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

D5-棕榈酸缩水甘油酯标准储备液：1 mg/mL(以缩水甘油计)，准确称取D5-棕榈酸缩水甘油酯标准品40.15 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至标线，摇匀。

氯丙醇酯和缩水甘油酯混合标准工作液：各组分质量浓度均为0.01 mg/mL，使用甲苯逐级稀释3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯(以3-氯丙醇计)标准储备液，2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯(以2-氯丙醇计)标准储备液和棕榈酸缩水甘油酯(以缩水甘油计)标准储备液得到。

内标混合液：各组分质量浓度均为0.01 mg/mL，使用甲苯逐级稀释D5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯(以3-氯丙醇计)标准储备液，D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯(以2-氯丙醇计)标准储备液和D5-棕榈酸缩水甘油酯(以缩水甘油计)标准储备液得到。

氯丙醇酯和缩水甘油酯系列混合标准工作溶液：准确移取氯丙醇酯和缩水甘油酯混合标准工作液和内标工作溶液适量于7 个22 mL 提取池中，按1.4 步骤与试样同时处理。得到质量浓度均分别为0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 和1.60 mg/L 的氯丙醇酯和缩水甘油酯系列混合标准工作溶液，其中内标的质量浓度均为0.25 mg/L。

1.4 实验方法

1.4.1 样品溶液制备

准确称取婴幼儿配方乳粉样品2 g(精确至0.001 g)，置于22 mL 提取池中，加入25 μL 混合内标工作液，进入快速溶剂萃取仪提取。将接收液转移至玻璃离心管中，于40 ℃水浴旋蒸至近5 mL，将浓缩液转移至试管中，于40 ℃条件下，氮气浓缩至近干，再加入2 mL 四氢呋喃，涡旋溶解，作为待反应液。

向待反应液中加入30 μL 酸性溴化钠溶液[溴化钠3 mg/mL，硫酸溶液(体积分数为5%)]，旋紧盖子，混匀后于50 ℃水浴中反应15 min，加入3 mL 6 g/L碳酸氢钠溶液终止反应。随后加入2 mL正己烷，涡旋静置后，取上清液于另一干净螺口玻璃试管中，于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 四氢呋喃溶解残渣，随后加入1.8 mL体积分数为1.8%的硫酸甲醇溶液，混匀，旋紧瓶盖，置于40 ℃恒温水浴中反应16 h。加入0.5 mL 饱和碳酸氢钠溶液终止反应，氮吹除去有机溶剂，向剩余溶液中依次加入2 mL 0.2 g/mL 硫酸钠溶液、2 mL 正己烷，涡旋静置分层后，弃去上层正己烷相，再用正己烷重复萃取净化1 次。向下层净化液中加入300 μL 0.25 g/mL 苯基硼酸溶液(溶剂为体积比为19∶1 的丙酮-水)，混匀，于室温下超声5 min。取出后，采用正己烷提取2 次，每次用2 mL 提取上层液至另一洁净的玻璃试管中，于40℃氮气吹至近干，用1 mL 正己烷溶解残渣，涡旋10 s，经0.45 μm 尼龙微孔滤膜过滤后进行测定。

1.4.2 定量方法

样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油酯的测定结果分别以3-氯丙醇、2-氯丙醇和缩水甘油计，用色谱峰面积内标法定量。根据各自的标准工作曲线分别可得到试样溶液中3-氯丙醇、2-氯丙醇和缩水甘油的质量浓度，结合试样溶液的定容体积和样品的称取质量，计算得到样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油酯的含量。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱-质谱条件的优化

因分析物与色谱柱固定相具有相似化学性质时才会产生相互作用，故选取的3 种目标化合物宜采用弱极性色谱柱进行分析。将2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯、3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯及棕榈酸缩水甘油酯用甲苯分别配制成50 μg/mL 的单一标准溶液，相应的3 种内标物分别用甲苯配制成25 μg/mL 的单一标准溶液，3 种目标化合物及其内标物经过卤化、净化、衍生后，用全扫描方式进行测定，根据目标化合物色谱保留时间优化气相色谱-质谱的升温程序，得到最优的色谱-质谱条件。在优化条件下，3 种目标化合物及其内标物的总离子流图见图1。由图1 可见，3 种目标化合物及其内标物实现了有效分离，可以分别定量。

图1 3 种目标化合物及其内标物总离子流色谱图

2.2 样品前处理条件的优化

采用快速溶剂萃取法对婴儿配方奶粉中氯丙醇酯和缩水甘油酯进行提取，用单因素实验分别优化提取试剂(正己烷、二氯甲烷、甲苯)、提取时间(4、6、8、10、12 min)、提取温度(50、100、150、200 ℃)及提取循环次数(1、2、3 次)。准备待测样品45 份，加入50 μL 内标混合液，在不同提取试剂、提取时间、提取温度和提取循环次数下，按照1.3.1 方法处理，重复3 次取平均值，内标物的峰面积图见图2。

图2 不同提取条件下内标化合物峰面积图

由图2 可知，甲苯提取效率最高，但甲苯对操作人员和环境危害大，本着实验试剂对人与环境最友好、样品提取效率最大化、试剂使用量最小化的原则，最终选取正己烷作为提取试剂，100 ℃提取8 min，循环提取2 次。

2.3 线性方程与检出限

在优化的色谱条件下测定氯丙醇酯和缩水甘油酯系列混合标准工作溶液，以目标物与内标物浓度比值(x)对目标物与内标物峰面积比值(y)绘制标准工作曲线，以3 倍信噪比计算检出限，以10 倍信噪比计算定量限，目标化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2 可知，婴幼儿配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和缩水甘油酯在0.01～1.60 mg/L 范围内的线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限均为10 μg/kg，定量限均为25 μg/kg，表明该方法灵敏度较高。

表2 目标化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 加标回收率与精密度

在婴幼儿配方乳粉空白样品中分别添加62.5、125、250 μg/kg 3 个水平的2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯、3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯和25、50、100 μg/kg 的棕榈酸缩水甘油酯标准品，每个水平平行测定6 次，试验结果见表3。由表3 可知，平均回收率为84.3%～103.0%，测定结果的相对标准偏差不大于6.0%，表明该方法具有较高的准确度和精密度，满足实际样品测定需要。

表3 加标回收试验和精密度试验结果

2.5 比对试验

在婴幼儿配方乳粉中添加50 μg/kg 3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸双酯、2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸双酯和棕榈酸缩水甘油酯标准品，分别采用SN/T 5220—2019 《出口食品中3-氯丙醇酯及缩水甘油酯的测定 气相色谱-质谱法》提供的超声提取法和本法(快速溶剂萃取法)进行测定，计算回收率，比对试验结果见表4。由表4 可知，采用快速溶剂萃取法提取效率更高。

表4 比对试验结果

3 结语

建立了快速溶剂萃取-酸性酯交换-气相色谱-质谱测定婴幼儿配方乳粉中氯丙醇酯和缩水甘油酯的分析方法。采用改进的样品前处理方法及优化的色谱-质谱条件后，可对婴幼儿配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和缩水甘油酯同时进行准确定量分析。该方法简单、高效、灵敏、准确，可为婴幼儿配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和缩水甘油酯污染水平的日常监测提供技术支持。