绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺基体标准物质制备

林涛，李梦霞，郭瑾，陈静，李茂萱，李彦刚，刘宏程

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明 650205；2.云南工商管理学院医学院，昆明 650106；3.云南省农业科学院茶叶研究所，昆明 650205)

绿茶是中国的主产茶叶之一，具有抗氧化[1]、提高免疫力[2]、抗癌[3]、防辐射[4]、抗菌[5]等多种保健功效。近年来，健康保健食品日趋受到公众青睐，绿茶消费量逐年上升。随着绿茶需求量的增大，以往小规模的种植模式已远远不能满足目前需求。随着种植面积的扩大和产量的提高，化学农药在绿茶种植中的使用量也逐渐增大，绿茶中的部分农药残留会对人体造成潜在的威胁[6-7]。

毒死蜱和唑虫酰胺是两种高效的杀虫剂，在茶叶种植过程中使用较多，在绿茶产品中的检出率也较高[8-9]。目前毒死蜱因其在蔬菜中超标率较高且有中等毒性，在我国被禁止使用，而毒死蜱和唑虫酰胺在茶叶中均可使用，但基于毒死蜱的中等毒性[10]和唑虫酰胺对水生生物的强毒性[11]，我国食品中农药最大残留限量标准(GB 2763—2021)[12]对茶叶中毒死蜱和唑虫酰胺最大残留限量进行了严格规定。

在GB 2763—2021 中，茶叶中毒死蜱的推荐测定方法为气相色谱-质谱联用法，唑虫酰胺的推荐检测方法为液相色谱-串联质谱法。由于绿茶中的化学成分较多，基质复杂，在农药测定过程中常出现较强的基质效应，导致绿茶中相关农药的准确定量难度增大[13]。通常情况下，在样品处理过程中，加入同位素内标可以减小基质效应[14]，但同位素内标通常价格较高且不常见；将提取液稀释后测定也能在一定程度上降低基质效应，但是随着稀释倍数的增大，分析灵敏度随之降低[15]。目前，较为有效的方法是在测定时，采用基体标准物质作为质量控制手段[16-17]，但是目前绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺的基体标准物质的研制在国内属于空白。基于此，笔者研制绿茶毒死蜱和唑虫酰胺基体标准物质，为绿茶中农药含量测定、测定值溯源等提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

三重四极杆串联质谱仪：API4000 型，美国AB Sciex 公司。

超高效液相色谱仪：1290 型，美国安捷伦科技有限公司。

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 型，50 mm×1 mm，1.7 μm，美国Waters 公司。

气相色谱-三重四极杆质谱仪：7000D 型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：XSR225DU/AC 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多科技(中国)有限公司。

乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇：色谱纯，德国默克公司。

无水MgSO4、乙酸钠、NaCl、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸二钠盐倍半水合物：分析纯，北京国药集团化学试剂有限公司。

乙酸、甲酸、乙酸铵：色谱纯，迪马科技（天津）有限公司。

陶瓷均质子、ProElut C18、PSA、GCB 填料(Φ50 μm)：迪马科技（天津）有限公司。

毒死蜱标准物质：100 μg/mL，标准物质编号为GBW(E)082239，江苏坛墨质检科技股份有限公司。

唑虫酰胺标准物质：100 μg/mL，标准物质编号为A17591500ME-100，德 国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

毒死蜱原药：有效成分质量分数为97%，批号为PD20121017，江苏常隆农化有限公司。

唑虫酰胺原药：有效成分质量分数为98%，批号为PD20190042，山东海利尔化工有限公司。

实验用水：纯净水，杭州娃哈哈公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿茶中毒死蜱、唑虫酰胺基质样品的制备

选取健康的茶树20 棵，将毒死蜱和唑虫酰胺原药用水稀释后，按照有效成分质量浓度为1 mg/L 进行喷洒，分别于采收前20 天和10 天各喷洒一次，采收鲜叶5 kg，按照绿茶的加工工艺，即经过采青、萎凋、杀青、揉捻、干燥等步骤后制成成品茶，粉碎后过孔径180 μm 筛(80 目)后，充分搅拌3 次以上使其混匀，即得。

1.2.2 基体标准物质样品的分装

采用50 mL 的HDPE 塑料小瓶进行分装，每瓶分装10 g，共分装100 瓶，室温下避光贮存。

1.2.3 基体标准物质样品的均匀性检验

从分装好的样品中按照随机取样的原则抽取10 瓶，每瓶称取3 份，每份2 g 进行测定，按照GB 23200.121—2021 中测定方法进行测定，测定结果用F检验进行均匀性检验。

1.2.4 基体标准物质样品短期稳定性考察

将样品分别置于4、20、40 ℃恒温箱中(模拟运输条件)保存，分别在第0、3、5、7、14 天进行监测，每份样品测定5 次，用测量平均值作为测定结果。用t检验对测量数据进行统计分析。

1.2.5 基体标准物质样品长期稳定性考察

选取第0、1、3、6、12 个月取样检测。每次取两瓶样品，每个样品称取3 份，每份样品测定5 次，以平均值为测定结果。用t检验对数据进行统计分析。

1.2.6 基体标准物质的定值

(1)定值方法。毒死蜱液相色谱-串联质谱法[19]定值；唑虫酰胺分别采用文献[19-20]样品处理方法，利用气相色谱-质谱法[21]进行测定。

(2)实验室联合定值。选取代表性的相关检测机构8 家，采用标准方法[19]，分别对样品中的毒死蜱和唑虫酰胺的含量进行测定。随机抽取24 瓶样品，每个定值实验室3 瓶，每瓶平行测定2 次。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验结果

均匀性检验方法参照国家标准GB/T 15000.3—2008[18]。利用F检验确定绿茶样品的均匀性数据是否符合正态分布。绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺均匀性检验质量分数及方差分析结果分别见表1、表2。

表1 绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺均匀性检验质量分数测定结果 mg/kg

表2 绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺均匀性检验测定数据方差分析结果

由表2 可知，组间自由度υ1=9，组内自由度υ2=20，查F界值表得F0.05(9，20)=2.39。经计算，毒死蜱F=1.49，唑虫酰胺F=1.22，F＜F0.05(9，20)，表明所制备的标准物质样品是均匀的。

2.2 短期稳定性检验结果

根据标准要求[18]，按照1.2.4 方法进行标准物质样品的短期稳定性检验，并对检验数据进行t检验，毒死蜱和唑虫酰胺含量测定值及统计结果分别见表3 和表4。由表4 可知，该标准物质样品短期稳定性良好。

表3 短期稳定性检验质量分数测定结果 mg/kg

表4 短期稳定性检验数据统计结果

2.3 长期稳定性检验结果

根据标准[18]要求，按照1.2.5 方法进行标准物质样品的长期稳定性检验并对检验数据进行t检验，毒死蜱和唑虫酰胺含量测定值及统计结果分别见表5、表6。由表6 可知，该标准物质样品长期稳定性良好。

表5 长期稳定性检验质量分数测定结果 mg/kg

表6 毒死蜱和唑虫酰胺长期稳定性检验数据统计结果

2.4 定值结果

2.4.1 基体标准物质样品的定值结果

8 家实验室对标准物质样品中毒死蜱和唑虫酰胺的联合定值结果见表7。

表7 毒死蜱和唑虫酰胺联合定值质量分数测定结果 mg/kg

采用格拉布斯检验法对表7 测定结果进行检验，未发现异常值，测定结果呈正态分布，按照标准的相关规定进行结果计算[18]，毒死蜱和唑虫酰胺联合定值结果数据见表8。

表8 毒死蜱和唑虫酰胺联合定值结果

2.4.2 定值不确定度计算

使用的电子天平分辨率为0.000 01 g，最大允许误差为0.000 10 g，按均匀分布，k= 3，仪器产生的不确定度：

依据测定结果，绿茶中毒死蜱的标准值为0.295 mg/kg，扩展不确定度为0.027 mg/kg(置信区间为95%，k=2)。

(2)唑虫酰胺的定值不确定度。唑虫酰胺均匀性检验的不确定度ubb=0.004 mg/kg，短期稳定性检验引入的不确定度：

依据上述测定结果，绿茶中唑虫酰胺的标准值为0.373 mg/kg，扩展不确定度为0.023 mg/kg(置信区间为95%，k=2)。

3 结语

研制了绿茶中毒死蜱和唑虫酰胺基体标准物质，其中毒死蜱的标准值为0.295 mg/kg，扩展不确定度为0.027，唑虫酰胺的标准值为0.373 mg/kg，扩展不确定度为0.023(置信区间为95%，k=2)。该标准物质的均匀性较好，在4、20、40 ℃温度下14 天内短期稳定性较好，室温下12 个月的长期稳定性较好，符合基体标准物质的要求。