荧光标准研究进展

蒲玲

(上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114)

光致发光技术，可以分析物质特定的量，如发射光谱、激发光谱、量子产率、发光寿命和发光各异性，它是材料和生命科学中最为广泛使用的工具之一[1-7]。分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等类型。荧光是光致发光的一种，是物质从吸收光能跃迁至激发态后，又返回基态能级时所发射的光[8]。在常温下，荧光生色团分子处于基态最低振动能级，处于基态的分子吸收能量(光能、化学能、电能或热能)后跃迁至激发态，激发态不稳定，将很快重新衰变回基态，衰变过程中释放的能量以光的形式释放出来，产生发光现象。由于发光物质不同，荧光有分子荧光和原子荧光之分，分子荧光为带光谱，原子荧光为线光谱，通常所说的荧光为分子荧光。通过测定所发射荧光的特性和强度，可以对物质进行定性、定量分析。

基于荧光检测的一般程序是将荧光团偶联到某个探针上，并测定生物分子中探针的指标荧光来达到检测的目的。除了荧光偶联化学的发展外，还开发了特殊的仪器来检测这些荧光探针，如流式细胞仪、数字荧光显微镜、荧光法酶标分析仪、流式细胞仪、荧光定量PCR 等。与常规仪器方法相比，荧光分析法在生理条件下的应用具有许多特点，如有较高的灵敏度、较好的选择性、操作简单、成本低、响应快、能实时检测等优点。

随着荧光技术的发展和荧光类设备的广泛应用，荧光设备的性能验证、计量溯源、日常质量控制的需求也越来越多，用于对荧光设备计量性能控制的荧光标准的需求也逐渐增多。建立可靠、可比较的荧光测量需要根据仪器类型和具体的应用，对仪器的波长和光谱狭缝宽度精度、检测系统线性、发射系统的光谱响应(检测系统的响应性或发射光谱校正)、到达样品的光谱辐照度(激发光束强度的光谱校正)、灵敏度(分析物的检出限)和日常性能进行验证。

自1972 年以来，ASTM 已经在E13.01 紫外、可见光和发光光谱小组委员会的管辖下提供了荧光光谱的标准测试方法，包括波长精度和光谱分辨率的测试(E388)[9]，检测系统线性度测试(E578)[10]和检出限测试(E579)[11]等标准方法。目前荧光技术的应用依赖于仪器分析，通过仪器分析可以分析物质的特异性荧光信号，但是目前绝对荧光强度的测量方法较少且不方便实施。荧光标准直接影响了荧光测量仪器的表征和性能验证，测量数据的溯源性，仪器间数据的可比性，因此荧光标准的研究对于更好的推广荧光技术、建立更高标准的测量具有重大的意义，目前比色法和部分流式细胞术[12]在标准化方面做得比较好，是大多数发光测量技术标准建立的范例。

1 荧光标准的分类

荧光标准根据其适用范围和应用范围可分为仪器校准标准、荧光仪器性能的验证标准、特殊应用的标准，根据所应用的场景，这些标准既可以是物理标准也可以是化学标准。物理标准通常是以设备的形式出现，如标准光源、校准过的检测器等[13]。物理标准通常又被称为物理传递标准(PTS)，在校准仪器时，将一个已知的量值传递至仪器。化学标准是基于发光团的液体或固体参考物质。根据化学荧光标准的应用范围，化学标准又分为波长标准、发射标准和激发标准等。与物理标准一样，化学标准可用于传递荧光强度量值，但是目前都是通过相对荧光强度进行量值传递，绝对荧光强度仍然是一个难题。可溯源的测量是实现世界范围内可比性的基础，实验室应通过形成文件的不间断的校准链将测量结果与适当的参考对象相关联，建立并保持测量结果的计量溯源性[14]。一般荧光溯源链是低温辐射计和黑体辐射体通过绝对测量将量值传递给物理传递标准(如检测器标准、光源标准)、物理传递标准又通过绝对或相对测量将量值传递给参考荧光计，参考荧光计通过绝对或相对测量将量值传递给化学传递标准(如荧光光谱标准、校正的发射光谱、强度标准等)，最后通过校准的方式将量值传递给日常使用的荧光仪器，从而实现荧光数据的可比性。

1.1 仪器校准用荧光标准

仪器校准用标准是用来确定和校准仪器的偏差，保证仪器的计量技术性能能满足测量要求。这类标准可以是物理器具也可以是标准物质，它们可以用来确认仪器的性能，从而使得荧光类仪器能得到与仪器无关但可比较的荧光数据。

1.2 荧光仪器性能验证标准

荧光仪器性能验证标准可用于定期对荧光仪器进行性能验证，这类标准可以是物理标准或者化学标准。根据需要验证的参数，它可以与仪器校准用的标准相同。性能验证和验证标准是荧光仪器最广泛需要的标准，通过性能验证来确保测量的一致性。仪器性能验证标准应是在相同的实验条件下，荧光强度不随时间推移而变化，最好与普通样品(如试管或96 微孔板)的测量几何形状相匹配。与校准的光谱等传统标准不同，非专业人员也容易掌握这类标准的使用方法。商业化的固体和液体标准样品，大多可做成比色皿的形式，以便于开展日常设备的性能验证。通常固体样品的光稳定性比较好，液体样品可以应用在不同的样品容器而使得应用更加广泛。荧光强度标准在仪器性能验证中应用最广泛，通过(相对)光谱强度的测量来检查仪器的日常性能和长期稳定性，这类标准可以不溯源或认证。

1.3 特定用途的荧光标准

特定用途的荧光标准是用于协助测定某些光致发光量或通过相对荧光强度的测量来比较荧光溶液的浓度。这类标准具有与测量范围相关的特性，与待测样品的特性也相似，包含有荧光强度、荧光寿命、荧光各向异性、荧光量子产率、发射各向异性、荧光寿命等标准。

2 荧光标准的质量要求

良好的荧光标准必须是能用常规仪器、常规设置来测量，否则在荧光标准的应用中会受到很多的限制。通常荧光仪器的参数应考虑狭缝宽度(或光谱带宽)、检测器的电压和检测模式、单色器、偏振器设置、测量的几何模型以及积分时间(或扫描时间)，配备有脉冲光源类仪器的脉冲持续时间和延迟时间等。

物理传递标准的强度通常高出普通荧光化学物质强度的2～4 个数量级，化学标准的发光团与被测样品有相似的发射特性，在日常应用中化学标准实用性和适用性更加广泛。大多数发光团的吸收和发射光谱、摩尔吸收系数、量子产率、发光寿命、荧光偏振或荧光各异性等光谱性质与其温度、粘度、溶剂、极性、质子化、pH 值、离子强度、发光偏振或各向异性等微环境有关[15-16]。完美的化学荧光标准品应易于使用，在溶液中足够稳定，吸收和发射光谱范围覆盖被测化合物的光谱范围，能够给出其波长范围内发射或激发光谱形状，具有独立于激发波长的发射光谱和独立于发射光谱的激发光谱，激发光谱和发射光谱之间应尽可能少的重叠，具有各向同性发射(荧光各向异性标准除外)，荧光特性对温度的依赖性较小，不易被氧淬灭，易于纯化。物理标准需知道特定波长下的光谱辐射亮度或光谱响应度。化学标准则要考虑内滤光响应、样品边界的折射、荧光团发射的各向异性，在选择荧光团和测量条件时，要尽量考虑减少以上这些因素的影响，以减小对常规测量的影响。

3 荧光标准的研究进展

3.1 波长准确性标准

波长准确性可以通过测量光谱和已知光谱的位置的波长比较来得到。在紫外/可见/近红外光谱区域内，有各种商品化的标准样品和标准灯，可以用来测定发射探测系统或激发波长选择器的波长精度。

常见的波长准确度标准包括有低压原子灯[9]、镝钇铝石榴石晶体(Dy-YAG)[17]、铕掺杂的玻璃或铕掺杂的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、掺蒽的PMMA、掺有氧化钬溶液或荧光染料的玻璃[18-19]、氙(Xe)灯[20]、带有漫反射器或散射器的仪器源[20]、水拉曼等。

低压原子灯因尺寸和形状像笔通常被称为笔灯，它通常被放置在样品位置用于激发波长准确度的测定。镝钇铝石榴石晶体可以做成标准比色皿的样式，能方便的插入到比色皿支架进行激发或发射波长的准确度测定，但是标准中靠得太近的不能被仪器分辨的峰不能用于波长准确度的测量。铕掺杂的玻璃或铕掺杂的PMMA 可以做成标准比色皿的样式来用于激发或发射波长准确度的测量，此类标准的峰值可能会因玻璃基质和样品温度的变化而改变。掺蒽的PMMA、掺有氧化钬溶液或荧光染料的玻璃也可做成标准比色皿的样式用于激发或发射波长准确度的测量。氙灯适用于使用高压氙灯作为发射光源的荧光仪器的波长准确度的测量。极窄发射带的波长标准，特别是低压原子放电灯，可以用于测定荧光测量系统的光谱分辨率。校准高精度荧光光谱仪的波长，通常需要选择在紫外/可见/近红外光谱区有极窄发射谱线的气体原子灯，此类灯内含有汞、氩气、氖气等混合气体，发射光谱峰的位置会受气体压力的影响而变化，因此原子灯的标准值需要制造商提供。原子灯的光谱发射强度比化学荧光标准品大很多，通常需要使用衰减器来避免检测器光饱和。对于光谱分辨率较低的仪器，如微孔板类荧光测量仪器或共聚光谱成像系统(光谱带宽在5～30 nm 之间)，不需要选择原子气体灯作为标准来校准仪器，选择基于发光团的化学标准来进行波长的校准就能满足技术要求。

3.2 相对荧光强度标准

测定荧光仪器的(相对)发射光谱响应值的标准有经校准的标准灯和发射标准，这类标准必须有已知的发射光谱，理想情况下这类标准的波长范围应覆盖被测样品所需的波长范围[21-22]。常用的测定荧光测量仪器发射光谱的标准有以下几种：

(1)含有汞和氩气混合气体的原子灯，建议用于验证高精度荧光计的波长确认(发射狭缝宽度不大于0.25 nm)；

(2)掺杂多种稀土金属离子的荧光玻璃，通常用于低光谱分辨率荧光测量系统的波长精度的测定和验证；

(3)积分球式辐射体，该标准认证的光谱辐射度原则上等于其校正后的发射光谱；

(4)经认证的标准物质或参考物质。

典型的物理光谱辐射传递标准，如钨灯、积分球式辐射体灯等具有非常宽的发射光谱，但是它们的发射强度均超过常用荧光样品的荧光强度至少2～4 个数量级，因此不适用于常规分析用荧光计。大多数荧光测量系统更适合使用经认证的化学发射光谱标准。在分子荧光分析计量领域，国外主要有美国国家标准与技术研究院(NIST)研制的编号为SRM2940～2944 的一系列荧光校准用标准物质以及德国联邦材料检验研究院(BAM)研制的编号为BAMF001～F005 的一系列荧光校准用标准物质，国内相关的标准物质有GBW(E)130100 硫酸奎宁荧光标准物质、GBW(E)136758DCM 正丙醇溶液相对荧光发射强度标准物质、GBW(E)136757DPA邻二甲苯溶液相对荧光发射强度标准物质、GBW(E)136756 罗丹明B 甲醇溶液相对荧光强度标准物质。化学发射标准的校正发射光谱可以在已溯源至物理传递标准的荧光计上测量。发射标准应具有中高量子产率，以增强信噪比，减少杂散光、溶剂和杂质对荧光光谱的影响。荧光发射各异性决定了荧光标准是否需要配备偏振片一起使用，当荧光发射各异性小于等于0.05 时，可以不使用偏振片。

测定荧光仪器的(相对)激发光谱响应值的标准有经校准的检测器和激发标准。典型的标准有已知光谱响应率或已知的校正荧光激发光谱物理传递标准如硅光电发光二极管和经认证的化学标准，若使用稀释荧光染料做标准，其光程为1 cm 时吸光度应小于等于0.05。

3.3 荧光强度标准

荧光强度标准是通过比较样品的荧光强度与标准品的荧光强度来测量荧光物质的浓度，荧光强度标准大多数情况下是化学标准。将化学浓度与仪器响应关联起来，通过比较标准品和样品的荧光强度来进行定量测量，这种荧光标准通常需要被测样品与标准有相同的荧光团。将化学浓度与仪器响应联系起来的标准应在相同的测量条件下，将样品的光谱辐射度或荧光强度与已知荧光团浓度的标准进行比较，从而量化荧光团的浓度或数量[23]。如NIST 提供的荧光素标准溶液SRM1932 旨在用于建立基于等效可溶性荧光团(MESF)单元分子的荧光强度参考标准[24]，这种强度标准通常依赖于与相同的待量化的荧光团。一个经典的例子是使用荧光检测的高效液相色谱(HPLC)对荧光分析物，如多环芳烃(PAHs)进行定量分析，是在相同或非常相似的化学成分的溶液中，对自由荧光团(即未结合荧光团)的荧光强度进行比较，待测发色团和标准品处于相同的微环境中，因此具有相同的荧光光谱、摩尔吸收系数和荧光量子产率，可以推导出样品中荧光团的绝对数量。

为了比较自由荧光团和固定荧光团，样品和标准中染料的微环境不同如附着在珠、颗粒或大分子和生物分子上的染料，开发了等效荧光强度标准的概念，这个概念是用一个简单而相对的强度标尺，使得在不同的仪器、实验室和同一种仪器之间的测试具有可比性。基于等效可溶性分子荧光团(MESF)开发的流式细胞术[25-27]，是通过在明确定义的微环境中使用与样品(即荧光标记)相同的荧光团来最小化环境对荧光团定量的影响。这些方法不能提供样品中荧光团的绝对数量，但提供一个近似的数字从而进行更加广泛的定量测试。NIST 提供的荧光标准物质SRM1934 就是其中一个例子，该标准包含荧光素溶液、尼罗红溶液、香豆素溶液和别藻蓝荧光蛋白水溶液，可提供可见光谱范围内定量流式细胞术的荧光强度标准[28]。

3.4 荧光寿命标准

荧光寿命标准，用于校准或测试发光寿命测量的时域和频域仪器的分辨率[27]。时间和频率荧光寿命光谱学在纳秒到更低的皮秒时间范围内是有价值的。它们可以用于确定(波长相关的)检测系统在同一发射波长下的时间响应，从而消除色移。合适的寿命标准必须在常使用的发射波长下，具有与激发和发射波长无关的恒定寿命的单指数衰减，而且它们的寿命能覆盖典型测量样品的寿命，可以使用单一的单指数衰减荧光团，或已知染料的荧光团-猝灭剂通过调整猝灭剂浓度来调整荧光物质的发射寿命。

由于许多样品显示双指数、多指数或非指数衰减，具有更复杂的衰减行为，通过混合两种或两种以上的荧光溶液，可以得到较好的标准物质。IUPAC关于时间分辨荧光方法技术报告[27]中介绍了蒽、DPA、香豆素153 等纳秒和皮秒荧光寿命物质。

3.5 荧光量子产率标准

荧光量子产率标准在荧光测量中经常作为参考用于测定分析物的(相对)荧光量子产率[29-31]，通常这些标准与分析物荧光团不一样，但是能覆盖分析物的激发和发射光谱区域。

荧光量子产率是荧光团的一种固有性质，它量化了单位面积上吸收激发光子的数量所发射的荧光光子的数量，可以用荧光光谱仪测定光学样品的荧光量子产率。在相同的测量条件下，利用已知样品或参考样品的荧光量子产率来确定未知样品的荧光量子产率，是一种比较容易实现的相对测量方法。MAGDE 等[32]为各种溶剂中的罗丹明6G 和荧光素提供了绝对量子产率，还使用这些数据和早期报告的寿命来计算辐射和非辐射衰减率，这些数据有助于对一系列荧光标准的测量参数进行交叉检查。稀高氯酸或硫酸中的硫酸奎宁用作相对量子产率标准已有50 多年的历史，Rance 等[33]测定了硫酸奎宁、荧光素、罗丹明B、磺基罗丹明101 在不同溶剂中的量子产率，得到的量子产率稳定性均较好。

3.6 荧光各向异性标准

荧光各向异性标准用于校准或验证仪器的荧光偏振或各向异性的性能。这些标准应该在特定的激发和发射波长下，具有一组或一定范围的已知的各向异性。IUPAC 有关于荧光各向异性的测试方法[34]，文献中报道了荧光素、罗丹明、罗丹明101 等物质的稳态荧光各向异性和偏振数据，可以作为荧光各异性标准的研究参考材料和基础。

4 结语

荧光类设备的计量溯源、性能确认等工作直接影响着实验室的分析结果，从而影响生物行业的高质量发展。随着荧光技术的发展，荧光原理的设备在各类企事业单位和科研机构的应用越来越广泛，尤其是在生物领域，近年来随着生物技术的发展和疫情的爆发，荧光类设备的量值溯源和质量控制需求越来越大，对于荧光标准研究的重要性也逐渐显现，未来国家在构建荧光体系的计量标准体系上还有很多值得做的工作。