玉米素合成通路相关基因的克隆及表达

张咏祀，龙 芸，郑祖平，张红梅，刘小红，曹 丹，李仕伟

(1.西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637000；2.厅市共建甘薯及特色豆科作物种质创新与利用四川省重点实验室，四川 南充 637000；3.山西省农业科学院玉米研究所，山西 忻州 034000)

玉米是世界上第三大禾谷类作物，仅次于水稻和小麦，也是最重要的经济和饲料作物之一[1]。随着全球气候变暖，极端高温天气的频繁出现，在局部地区高温胁迫对玉米的生产已造成了极大危害[2-4]。在玉米的整个生育周期中，高温都会对其发育产生影响，但对高温最敏感的时期为开花阶段，主要是高温对花粉活力的影响，高温会导致花粉活力下降或败育，直接影响玉米授粉结实，造成减产和品质下降。因此，选育花粉能耐高温胁迫的玉米品种就显得极其重要。经过玉米育种家的不懈努力，已选育出少部分花粉能耐高温的玉米品种，如生产上常用的玉米品种中地88，其花粉能在42 ℃高温环境保存较长时间的活性。

不同玉米材料的花粉耐高温胁迫的能力不同，与其基因型及其表达差异有关。因此，有必要在分子水平上了解不同温度条件下花粉基因的差异表达，这有助于揭示玉米耐高温胁迫的分子机理。玉米耐高温为多基因控制的数量性状[5-6]，到底哪些基因与该性状有关，哪些为主效基因，哪些为微效基因，这方面的研究鲜有报道。玉米素属细胞分裂素，在控制细胞生长和分化过程中起着重要作用，同时也与植物耐高温胁迫相关。因此，研究不同耐高温玉米材料玉米素生物合成相关基因在高温胁迫条件下的差异表达具有重要意义。

转录组测序是克隆分析差异表达基因结构及表达的重要手段，其突出优点是一次可分析整个基因组基因的差异表达，这在许多动植物中都有报道[7-10]。基于此，本研究选用耐高温胁迫的玉米品种中地88和不耐高温的先玉335为试验材料，通过转录组测序分析玉米素生物合成通路中的基因结构及差异表达情况，旨在初步认识玉米花粉耐高温胁迫的机制，为进一步克隆利用玉米耐高温胁迫基因奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

选取耐高温胁迫的中地88和不耐高温胁迫的先玉335两个玉米品种为试验材料。将这两个材料种植于常温和温室大棚两个生态环境。

1.2 方 法

1.2.1玉米素合成相关基因的克隆

在玉米开花期，正午时分，大棚温度达到42 ℃时，取大棚中两个玉米材料的花粉，同时以常温状态下这两个材料花粉为对照，液氮速冻后，提取总RNA，再经mRNA纯化、反转录及转录本测序分析，以获得玉米素合成相关的差异表达基因。

1.2.2玉米素合成相关基因的生物信息学分析

对发现的玉米素合成相关基因，参考文献[11]、文献[12]，网络在线分析其基因序列，包括内含子数目、cDNA全长、编码蛋白数目、常见理化性质、磷酸化修饰位点、常见功能位点、二级结构和三级结构等。

1.2.3基因差异表达及代谢通路分析

根据转录测序结果，分析玉米素合成相关基因在不同材料不同生态环境下的表达情况，以3次重复的平均读段数(read count)计算基因表达量。同时，分析这些基因在玉米素生物合成代谢通路中所处的位置及其生物学作用。

2 结果与分析

2.1 克隆基因序列

通过转录组测序，得到在不同温度条件下玉米素合成通路中5个基因的cDNA序列，包括细胞分裂素氧化酶5基因(Zmco5)、异戊烯基转移酶4基因(Zmit4)、细胞分裂素氧化酶4 b基因(Zmco4b)、细胞分裂素氧化酶12基因(Zmco12)和顺式玉米素葡糖糖基转移酶1基因(Zmczg1)。进一步分析发现这5个基因分别位于玉米第8、7、8、2、2染色体；cDNA编码区长度分别为1 749 bp、1 095 bp、1 605 bp、1 587 bp和1 398 bp；全长基因含有的外显子数目分别为3、1、5、5个和1个，即Zmco5、Zmco4b、Zmco12为断裂基因，分别含有2、4、4个内含子，而Zmit4和Zmczg1没有内含子，其编码区是连续的。

2.2 基因的编码蛋白

开放阅读框分析结果显示，Zmco5、Zmit4、Zmco4b、Zmco12和Zmczg1基因编码蛋白的氨基酸数目分别为582、364、534、528、465个(图1～图5)，各自均含有20种常见氨基酸，其中带负电荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)数目分别为64、47、54、54、55个，带正电荷(精氨酸和赖氨酸)的氨基酸数目分别为55、52、48、49、48个。

图1 Zmco5基因编码蛋白的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco5 gene

图2 Zmit4基因编码蛋白的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmit4 gene

图3 Zmco4b基因编码蛋白的氨基酸序列Fig.3 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco4b gene

图4 Zmco12基因编码蛋白的氨基酸序列Fig.4 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco12 gene

图5 Zmczg1基因编码蛋白的氨基酸序列Fig.5 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmczg1 gene

表1 玉米素合成相关基因编码蛋白的理化性质Table 1 Physicochemical properties of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.3 蛋白的理化性质

基因编码蛋白的常见理化性质分析结果如表1所示。这5个蛋白中，分子量最高的是Zmco 5蛋白，最小的是Zmit 4蛋白，总的来说，其蛋白分子量大小与其含有氨基酸的数目呈正相关。从等电点分析结果可见，除Zmit 4蛋白为显碱性外，其余4个均显弱酸性。通过计算其不稳定指数发现，Zmco 5和Zmco 4 b蛋白在细胞中能稳定存在，而其余3个属不稳定蛋白。此外，从脂肪族指数和总平均亲水系数两个参数值可看出，这5个蛋白都属亲水性蛋白。

2.4 蛋白的磷酸化修饰

编码蛋白磷酸化修饰在线分析结果如表2所示，在这5个基因的编码蛋白中，苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基是常见的磷酸化修饰位点，这3种氨基酸修饰位点合计平均每个编码蛋白有38个，其中Zmco5基因编码蛋白的修饰位点最多，达到58个，其次为Zmco12基因编码蛋白，为44个，最少的是Zmit4编码的蛋白，仅有25个。

表2 玉米素合成相关基因编码蛋白的磷酸化修饰位点Table 2 Phosphorylation modification sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.5 蛋白的功能位点

玉米素合成相关基因编码蛋白的功能位点分析结果见表3，这5个蛋白一共包含9种不同功能位点，其中N-豆蔻酰基化位点为5个蛋白同时含有，其余位点为部分蛋白含有，ATP/GTP-结合位点基序A(P-环)、酰胺化位点与依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点相对稀少，在这5种蛋白中只有其中一种蛋白含有。

表3 玉米素合成相关基因编码蛋白的功能位点Table 3 Functional sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.6 二级结构和三级结构预测

二级结构预测结果见表4，在这5种蛋白中，包括的二级结构种类共有4种。除无规则卷曲区外，螺旋区最为常见，其中Zmco5和Zmczg1基因编码蛋白都含有18个该种位点，Zmit4和Zmco4b基因编码蛋白有17个，最少的Zmco12基因编码蛋白也有16个。有一个特殊现象是，Zmco5基因编码蛋白还含有1个位于第268位的精氨酸残基为假定的域边界位点。三级结构模拟的结果如图6所示。这5种蛋白都有较为复杂的三级结构，图中红色末端为N末端，蓝色末端为C末端。相对来说，分子量越大，其高级结构也越复杂。

2.7 基因表达及代谢通路分析

玉米素合成相关的5个基因在花粉中的表达统计结果如表5所示，表中数值为基因表达的三次重复的平均read count值。以常温为对照，对于耐高温胁迫的中地88来说，除Zmco5基因表达上调外，其余4个基因均显示为表达下调。与此不同的是，对于不耐高温胁迫的先玉335来说，Zmco5和Zmczg1均表达上调，其余3个基因表达下调。如以先玉335为对照，Zmco12和Zmczg1两个基因在高温环境下中地88表现为极显著表达下调，但在常温环境下，表达下调不显著。该结果也说明，这5个玉米素合成相关基因其表达同时受到温度和材料的影响。这几个基因在KEGG通路中，具有不同的功能。其对应的代谢通路为Zmco5、Zmco4b和Zmco12均为k 00279；Zmit4为K 10760；Zmczg1为K 13495。这几个代谢通路节点都在细胞内玉米素合成代谢途径中起着重要的作用。

注：A为Zmco5；B为Zmit4；C为Zmco4b；D为Zmco12；E为Zmczg1。图6 预测的玉米素合成相关基因编码蛋白的三级结构Fig.6 Predicted tertiary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表4 玉米素合成相关基因编码蛋白预测的二级结构Table 4 Predicted secondary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表5 玉米素合成相关基因的表达统计Table 5 Expression analysis of genes related to zeatin synthesis

3 讨论与结论

玉米素是控制玉米生长发育的重要激素，其表达与植株生长及抗逆密切相关[13-14]。玉米素在细胞内的生物合成非常复杂，从其代谢通路可知涉及到很多基因的表达产物[15-16]。就玉米而言，到底是哪些基因的表达参与玉米素的合成，这些基因的结构及其表达量与植株表型有何关系，相关研究鲜有报道。而转录组测序可以从整个基因组出发，研究某一器官或组织的所有基因的转录表达情况[17-19]，分析不同材料、不同生长部位在不同环境下的基因表达差异，以揭示其相关关系[20-21]。转录组测序技术在玉米这一作物中也有着广泛应用[22-24]。

许多研究表明，玉米花粉是对高温极其敏感的部位，高温胁迫会导致花粉活力下降，甚至完全败育，进一步影响玉米的产量和品质[25]。因此，培育花粉能耐高温胁迫的玉米品种十分必要，而从分子水平认识花粉中基因表达、玉米材料及环境条件三者之间的相互关系，有助于理解花粉耐高温胁迫的分子机理，而转录组测序分析是解决这一问题的有效手段。

因此，本研究借助二代测序技术，对中地88和先玉335两个玉米品种的花粉基因在不同温度条件下的表达情况进行了测序分析，发现有5个与玉米素合成相关的基因存在差异表达。这5个基因共分布于3条染色体，有3个为断裂基因，2个为连续编码基因。进一步分析了这5个基因的理化性质、磷酸化修饰、功能位点及结构。从基因的表达量来看，对于耐高温胁迫的中地88材料，这5个基因表达差异达到2倍以上，若以常温条件为对照，Zmco5基因表达上调，其余表达下调。但对花粉不耐高温的先玉335来说，有不一样的表现，Zmco5和Zmczg1为表达上调，其余3个为表达下调。这5个基因均处于玉米素生物合成通路中，对每一个基因的结构及功能的认识还需要进一步的试验分析，此工作尚在进行之中。本研究结果为理解玉米耐高温胁迫的分子机理提供了一些参考依据，为开展耐高温玉米品种选育奠定理论基础。