辅助生殖技术中PGT嵌合体胚胎的发生比例及处理对策

秦文松，刘英，秦辉灵，雷金凤，林慧，段金良

胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)是指在辅助生殖技术过程中，在胚胎移植入子宫前，活检胚胎细胞，对胚胎23对染色体进行分析，选择整倍体胚胎植入子宫，以期提高试管婴儿的成功率。但是有相关研究报道，PGT对胚胎的判断并不是“非黑即白”，而多了一个“灰色区域”需要被考虑，即嵌合体[1]。

嵌合体是指胚胎中存在两个或两个以上不同的染色体细胞系，是人类植入前胚胎的普遍特征[2]。嵌合主要是来源于受精卵细胞分裂过程中的有丝分裂错误，包括细胞周期检查点的改变、中心体的畸变、染色单体内聚力的下降[3]、单核苷酸变异以及小的插入/缺失等[1]。染色体的嵌合主要包括两种：一种是两个或两个以上的异常细胞系(如非整倍体/非整倍体) ；另一种是正常细胞系和异常细胞系(如整倍体/非整倍体)。与胚胎所有细胞的完全异常非整倍体相反，嵌合体可能通过多种机制发生，包括后期延迟、丝裂相分离、偶然的染色体破坏和DNA复制前的早期细胞分裂[2]。此外，嵌合性可能局限于发育中胚胎的某一特定区域，这对于囊胚阶段的胚胎尤其如此，在这个阶段，滋养外胚层中的细胞可能表现出嵌合性，而内细胞团不受影响。因此，如何正确对嵌合体胚胎的测序结果进行判读，如何选择合适的嵌合体胚胎移植风险最低便显得尤为重要,本文拟探讨PGT嵌合体胚胎的发生比例和处理对策。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年3月至2020年9月在中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院生殖医学部行PGT的276例患者，共704枚活检胚胎(囊胚)数据资料，满足以下条件之一者纳入统计：女方年龄≥38岁、反复流产(≥2次)、胚胎反复着床失败(至少连续3次胚胎移植周期且每周期至少有1枚优质胚胎仍未获得临床妊娠)、男女双方任意一方存在染色体异常(易位、倒位等)。入组患者经过促排卵、取卵、体外受精、囊胚培养，选择D5/D6为3BB及以上的囊胚进行活检(囊胚评分参考Gardner评分系统)，在内细胞团对侧进行激光辅助孵化，培养3～4 h后对孵出的外滋养层细胞进行活检，将活检的细胞装入PCR管后进行全基因组扩增，后将扩增产物送检测序(采用DA8600高通量测序平台完成全基因组测序)。该276例患者中，有6例患者无整倍体胚胎可供移植，仅有1枚或数枚单条染色体或单一片段嵌合异常(嵌合率≤50%)的胚胎。在进行遗传咨询并知晓相关遗传风险，提交伦理审查通过后，签署知情同意书，拟定胚胎解冻移植。

1.2 内膜准备及胚胎解冻移植

均采用人工周期进行内膜准备。患者于月经第3天口服戊酸雌二醇(补佳乐)2 mg/d，定期B超监测，视内膜情况调整补佳乐用量。待内膜≥8 mm时开始肌注黄体酮，于肌注黄体酮后第5天进行胚胎解冻移植，移植后继续黄体支持。

1.3 妊娠结局的确定

胚胎移植后14 d抽血验β-hCG，阳性者继续黄体支持，移植后28 d行B超见宫内孕囊及胎心搏动者确定为临床妊娠。

1.4 统计学方法

计数资料均采用率(%)进行统计学描述。

2 结果

2.1 胚胎高通量测序结果

总共活检胚胎704枚，其中染色体无明显异常胚胎为388枚，占55.75%(388/696)；异常胚胎为308枚，占44.25%(308/696)，8枚胚胎的活检细胞未通过质检未进行后续测序。

2.2 不同嵌合类型胚胎所占比例

将嵌合体胚胎划分成两组：a、多条片段嵌合异常；b、单条染色体或单一片段嵌合异常，并对其所占比例进行统计。结果显示：多条染色体或多条片段嵌合异常胚胎所占比例为31.17%(96/308)，单条染色体或单一片段嵌合异常胚胎所占比例为19.48%(60/308)。

2.3 移植嵌合体胚胎患者信息及临床结局

在移植嵌合体胚胎的6例患者中，生化妊娠率为50%(3/6)，临床妊娠率为33.33%(2/6)，流产率为33.33%(1/3)。在获得临床妊娠的患者中，嵌合率最低(33.33%)，且异常片段最短(19.35 Mb)的患者活产1女婴(外观无异常)。另一获得妊娠的患者，虽然异常片段较长(38.72 Mb)，但嵌合率也较低(38.1%)，最后活产1男婴(外观无异常)。具体结果详见下页表1。

表1 6例嵌合体胚胎移植患者情况及结局

3 讨论

嵌合体胚胎给PGT结果的解释以及患者的遗传咨询带来了新挑战。通过高通量测序技术及生物信息学技术获得的数据表明，应该报告和使用“嵌合”来帮助决定哪些胚胎应该优先移植[4]。Greco E等[4]对嵌合体胚胎移植进行了研究，结果表明大多数嵌合体胚胎不能移植或导致早期流产，但有一少部分嵌合体胚胎移植后可分娩健康的婴儿。中国台湾的Liu YL等[5]也做了嵌合体胚胎移植获得活产的相关报道。另外，还有学者研究了嵌合程度和涉及的非整倍体的类型(即染色体以及它是三体还是单体)对嵌合胚胎发育潜力的影响。其数据显示非整倍体细胞百分比低及单体或三体的胚胎更可能有机会植入[6-7]。本文的结果也显示，获得妊娠的胚胎其嵌合率均在40%以下。最近在小鼠染色体嵌合模型中获得的数据表明，嵌合率在50%的胚胎都能成功植入，而嵌合率在75%的胚胎只有44%能成功植入。根据这个模型，高比例的非整倍体细胞可以从囊胚阶段开始逐渐减少，进而降低对正常细胞的影响[8]。根据这些结果，可以认为嵌合体胚胎在活力方面代表了一个独特的类别，介于正常胚胎和完全异常胚胎之间。这种类型的胚胎可能导致着床和妊娠潜能降低，以及遗传异常和不良妊娠结局的风险增加。然而，还需要从前瞻性非选择性研究中获得更多的临床数据来评估胚胎的嵌合状态对于植入前胚胎发育潜能的临床预测价值。

针对嵌合体胚胎如何处理这一问题，国际专业组织召集了专家小组，提出了有关嵌合体胚胎移植的建议[9]。然而，公布的指南是在基于临床结果公开数据仍然有限的情况下编写的。有些建议可能还需要根据不断的调查结果加以探讨[10]。例如，胚胎植入前遗传诊断国际协会(Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS)建议，优先移植单倍体/整倍体嵌合型胚胎而非三倍体/整倍体嵌合型胚胎，因为常染色体单倍体一般高度不育，而某些常染色体三倍体结局是并发相关身体和认知障碍的活产。若打算将三倍体/整倍体嵌合型胚胎用于移植，PGDIS指南建议：① 优先考虑chr.1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、17、19、20、22、X、Y三倍体嵌合体；② 由于存在单亲二倍体可能，不考虑chr.14、15三倍体嵌合体；③ 由于存在宫内生长发育迟滞可能，不考虑chr.2、7、16三倍体嵌合体；④ 由于存在三体综合征活产可能，不考虑chr.13、18、21三倍体嵌合体[11-12]。

展望未来，希望科学技术的进步能够准确识别嵌合胚胎，减少对潜在可存活胚胎的丢弃，这将是一项重要的成就，尤其是对于那些卵巢储备不足、只能产生有限数量胚胎的患者，或者那些只检测到染色体异常胚胎的患者。精确分类嵌合胚胎的潜力可能是辅助生殖过程中的另一个额外工具，有可能降低丢弃嵌合胚胎的风险，提高助孕成功率。