云南月季根癌病的病原菌鉴定及生物防治技术研究

王丽花，农爱仙，孙爱青，许 凤，张丽芳，张艺萍*，杨秀梅*

（1.云南省农业科学院 花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室/国家观赏园艺工程技术研究中心,云南 昆明 650205；2.云南大学,云南 昆明 650504）

近年来，月季根癌病已然成为月季常见病害之一，在世界各地均有发生［1］。此病菌侵染月季健康植株后，在植株茎部、根部及剪口处或叶柄、叶脉上形成肿大瘤体，且随树龄的增加而逐渐变大，并争夺植株养分［2］，对月季切花和种苗生产造成严重影响［3-5］。根癌病原菌可以在土壤中长时间存活，传播侵染途径多样，如通过农事操作等创口侵入［6］、虫害取食［7-8］等形成近距离传播，伴随插穗及种苗销售可以形成远距离传播［2，8-9］，因而近年来其感染范围不断扩大。然而，随着月季种植面积逐年的扩大及单一品种规模化、专业化和产业化程度的提高，以及根癌病原菌的宿主广泛［6］，从源头上控制月季根癌病成为制约月季产业发展的“卡脖子”问题［10］。因此，国内外科技工作者开展了一系列相关的研究［2，9，11-12］，如韩新才等［13］使用50%氯溴异氰酸防治月季根癌病取得了一定的防效，但难以达到彻底杀灭的效果。

生物防治在土传病害防治中具有高效、经济和安全的突出优势［14］，其通过改善土壤或根系的微生态环境和生物多样性，达到控制病害的目的［15］。枯草芽孢杆菌和木霉菌是一类理想的生防菌［16-18］，因其广谱、高效的防控优点，近年来广泛应用于植物病害的绿色防控［19］，是目前商品化较成功的生防菌剂。该2类生防菌在自然界中分布广泛，对多种病原菌具有抑制作用。周淑香等［20-21］的研究表明：木霉菌对土传性植物病害具有抑制作用。胡娴等［22］在木霉菌的应用方面进行了探讨，发现其在土壤修复、病害防治、促进植物生长等方面均具有良好效果［23］。张兴华等［24］发现以棉种量10%的枯草芽孢杆菌种子包衣防治棉黄萎病，其防效达49.4%～56.6%。曹春霞等［25-26］证实了枯草芽孢杆菌能产生多种酶和抗生素，抗逆能力和广谱抗菌活性强，在小麦等10余种农作物的病害防治上取得了较好效果。本试验通过合成根癌农杆菌特异性引物［27-28］，以月季种苗植株上着生的肿瘤组织为材料，经DNA提取及PCR特异性扩增［29］，结合基于pTi基因的系统发育分析，开展分子生物学鉴定，并在此基础上开展了对发病植株施用不同生防菌剂的药效试验，以期为月季根癌病的有效防治提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌剂木霉菌为黑龙江八一农垦大学研发的木霉菌可湿性粉剂，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）有效成分为10 亿个/g；枯草芽孢杆菌为市售劲艳牌可湿性粉剂，有效成分为100 亿芽孢/g。试验感病植物材料为扦插成活3个月、生长状态较一致且携带病瘤体的月季杯苗185株（来源于通海），上述材料于2021年5月28日带回云南省农业科学院花卉研究所。随机抽取5株作为病原菌分子鉴定材料，放置于4 ℃冰箱中保存，其余180株使用泥炭∶珍珠岩为10∶1的新基质栽植于12 cm×14 cm花盆中，放置于温室，试验前统计每株的活性病瘤体数。后续应用常规水肥管理，仅在施药前一天或施药当日避免浇水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验在云南省农业科学院花卉研究所实验大楼旁温室内进行，试验处理设计见表1，其中松脂酸铜800倍液（S5）为化学农药对照，另设清水为空白对照（CK）。试验时M1、M2、K1、K2使用工作浓度均为300倍液，施用量100 mL/株，S5和CK分别浇施等体积松脂酸铜800倍液和清水。各个处理方案均处理10株植株，重复3次。于2021年5月31日开始第1次试验，每间隔7 d施1次，连续施用3次。

表1 供试材料处理方案

1.2.2 病原菌分子鉴定

1.2.2.1 总DAN提取 供试材料取新鲜瘤体及瘤体旁茎段，用灭菌水冲洗干净，切取瘤体外层组织、瘤体内部及茎段各0.1 g，分别提取总DNA。并设健康植株茎段作为阴性对照。植物组织总DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，提取方法均按说明书的步骤进行。

1.2.2.2 PCR扩增及构建发育树 PCR引物采用Suzaki等［27］报道的携带致病性Ti质粒的致瘤农杆菌特异性引物（上游引物VCF1-2004：5′-GGCGG GCGYGCYGAAAGRAARACYT-3′、下游引物VCR2-2004： 5′-AAGAACGYGGNATGTTGCATCTY AC-3′），反应体系为10×Taq PCR buffer（内含1.5 mol/L MgCl2）5 μL，200 mol/L dNTP 4 μL，50 U/μL Taq酶0.5 μL，VCF1-2004及VCR2-2004各1 μL，模板5 μL，加dd H2O至50 μL后进行PCR扩增。PCR产物测序后将所获得的片段序列上传至NCBI（美国国立生物技术信息中心）经BLAST比对，下载同源性为98%以上的部分基因序列，利用MEGAX软件，使用NJ模型构建系统发育树，bootstrap值设置为1000。以上试剂采购、PCR产物测序、引物合成均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2.3 药效试验数据分析 3次施药完成45 d后，即2021年8月2日观察并记录原瘤体失活数、新瘤体发生数、新芽萌发数及植株成活数，并分别计算各处理的原瘤体失活率、新瘤体抑制率、新芽萌发率及植株存活率，计算公式如下：

原瘤体失活率（%）=原瘤体失活数/原瘤体数×100%

新瘤抑制率（%）=（对照组新瘤数-处理新瘤数）/对照组新瘤数×100%

植株存活率（%）=处理死亡株数/处理总株数×100%

新枝萌芽指数=处理新枝萌芽数/对照组新枝萌芽数

1.2.4 月季根癌病病害的调查 于2021年8月对云南省玉溪市通海县月季种苗基地的16个主栽品种开展根癌病发病率调查。参照方中达［30］提出的方法，以五点取样法进行随机取样，每点调查30株，每品种累计调查150株，以发病株数和调查总株数的比值计算月季根癌病的发病率。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分子生物学鉴定结果

使用特异性引物VCF1-2004及VCR2-2004对病瘤体表面组织等3类感病样品提取的总DNA进行PCR扩增，优化后的扩增程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。终产物用1%的琼脂糖凝胶电泳后，3类感病样品约在414 bp处出现清晰特异性条带（图1），而健康植株茎段未扩增出条带。产物测序后获得的3条序列片段经BLAST比对，与GenBank中登录的Agrobacterium tumefaciens Ti质粒vir毒区序列的同源性均达98.92%以上。对编号为GA-8的病瘤体表面组织PCR产物片段系列采用MEGA软件构建系统发育树（图2），GA-8与A. tumefaciens聚类在同一分支，进一步证实月季根癌病的致病菌为A. tumefaciens。

图1 PCR特异扩增

图2 PCR产物GA-8的系统发育树

2.2 药效试验结果

由表2可知，不同的药剂处理及施用方式对月季根癌病的防控效果具有一定的差异性，相比于CK均有一定的防治效果，原瘤体失活率提高76.61个百分点以上，植株存活率提高6.66个百分点以上，新瘤抑制率大于20%，新枝萌芽指数大于1。枯草芽孢杆菌300倍液和木霉菌2种生防菌施用后效果差别不大，且与松脂酸铜800倍液的防治效果相当，均能对病瘤体起到失活作用（图3）。从总体结果上可知，枯草芽孢杆菌300倍液浇施（K4）防控效果最佳，原瘤体失活率达87.10%，新瘤抑制率达为60%，植株存活率为90%，新枝萌芽指数达1.13。在施用方式上，2种生防菌浇施比喷施效果稍好，这可能是喷施过程中部分药液挥发而导致了药效降低。

表2 感病植株药效试验效果

图3 植株施药前后对比

2.3 月季品种田间发病率调查

金辉、狮子座等15个切花月季主栽品种在云南广泛种植。从表3可看出，不同品种苗期植株对月季根癌病病原菌的敏感性不一致，具体表现为田间发病率的明显差异。黄蝴蝶、粉蝴蝶、狮子座等多头品种的发病率较高，对A. tumefaciens表现为感病。娜欧蜜、卡罗拉、骄傲、白雪、高雅爱人等品种的发病率较低，为抗病品种。不同品种对根癌病抗性有明显差异，这与赵小兰等［31-32］的研究结果具有一致性。笔者还发现不同地域、不同环境条件、不同栽培管理及不同种条来源对同品种的抗病性会有影响，具体原因有待进一步深入研究。

表3 切花月季品种根癌病田间发病率比较

3 讨论

国内对于月季根癌病的鉴定及化学农药防治在21世纪初期已存在一些报道［9，33-36］，但利用生防菌开展该病的绿色防控尚鲜有报道。本研究从月季感病植株着生的肿瘤组织及茎段直接提取总DNA开展致病菌分子生物学鉴定，并使用枯草芽孢杆菌菌剂和木霉菌菌剂两种生防菌剂对感病植株进行药效试验，最终鉴定出根癌病的致病菌为A. tumefaciens，且2种生防菌剂药效试验效果均良好。感病组织样品提取的总DNA采用特异性引物VCF1-2004及VCR2-2004进 行PCR扩 增 后，能获得约414 bp的条带，产物通过Blasta对比，与GenBank中登录的A. tumefaciens Ti质粒vir毒区序列的同源性达98.92%以上，经进化树系统分析，扩增产物之一GA-8片段序列跟A. tumefaciens聚类在同一分枝上，进一步证实月季根癌病的致病菌是土壤根癌杆菌。

对带病植株的药剂防病效果研究表明：综合原病瘤体失活率、新瘤体抑制率、新枝萌芽率及植株存活率，枯草芽孢杆菌300倍液浇施处理优于其他处理及CK，防效接近松脂酸铜800倍液处理，对根癌病的抑制和防治效果最佳，同时对植株的伤害也最小。木霉菌处理较枯草芽孢杆菌处理效果稍差，但对于根癌病具有一定的防治效果。在试验中还发现，完成3次施药后，研究小组即停止了对试验材料继续施用生物药剂，1个月后（约2021年8月初）发现，在少部分原有已失活瘤体附近发生了新的瘤体，根癌病呈现一定概率的病情反复。这说明枯草芽孢杆菌等生物菌剂对月季根癌菌的防控可能既有竞争杀灭作用，也有竞争抑制作用。当一定时间内无外援生防菌持续补充施入时，生防菌的定殖繁殖基数会变得相对较弱。在一定环境条件下（连绵阴雨天、高温高湿天气），被抑制的病原根癌菌具一定概率复发致病性，其可能会重新繁殖并侵染健康组织形成新的病瘤体。这也说明，施用生防菌剂开展病原菌的防控，并非一次施用就能够一劳永逸，还应根据各类生防菌的特点，在安全间隔期内足量施用，才能获得较好的防病效果。另外，由于试验地条件的不同，得出的结果会有所差异，本次试验大棚为简易大棚，且棚内透光率相对较差，应用本研究结论在智能温室中开展木霉菌对月季根癌病的防治，防治效果在理论上应优于本次研究结果。