高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定复方丹参片中12种成分及掺伪鉴别

范可青，凌 霞

（湖北省襄阳市公共检验检测中心，湖北 襄阳 441000）

复方丹参片是由丹参、三七、冰片制成的中药复方制剂.《中华人民共和国药典》（一部2020年版）在其含量测定项下，分别对丹参酮ⅡA、丹酚酸B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1及人参皂苷Re进行了限定，以控制药品质量[1-2].近年来，研究表明丹参中其它的有效成分，如丹参酮Ⅰ、丹参素钠、迷迭香酸、原儿茶醛、原儿茶酸等，也具有一定的药理作用[3-10].但常有不法分子以三七茎叶替代三七投料，而人参皂苷Rb3作为三七茎叶中特有的人参皂苷成分，可以将其作为指标鉴别三七茎叶和三七[11-12].高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法可进行190～800 nm的全波长扫描，得到包含运行时间、波长值和吸收值等信息的三维图谱，结合色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，为目标物的定性、定量分析提供更丰富的信息，广泛应用于食品、药品检测等领域.本文采用HPLCDAD法对复方丹参片中12种成分进行含量测定，极大地降低分析时间，同时也大大提高对复方丹参片的质量控制.

表 1 线性关系Table 1 Linear relationship

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱系统，SPD-M20A二极管阵列检测器，Inertsil ODS-3液相色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)（均产自岛津制作所）.

丹参素钠（110855-201614）、原儿茶酸（110867-201607）、原儿茶醛（110810-201608）、迷迭香酸（111871-201706）、丹酚酸B（111562-201716）、三七皂苷R1（110745-201820）、人参皂苷Rg1（110703-201832）、人参皂苷Re（110754-201626）、人参皂苷Rb1（110704-201726）、人 参 皂 苷Rb3（111686-201504）、丹参酮ⅡA（110766-201721），丹参对照药材（120923-201615），三 七 对 照 药 材（120941-201409），以上对照品、对照药材均来源于中国食品药品检定研究院；丹参酮I（BWB50261-113107）来源于北京世纪奥科生物技术有限公司.42批次的复方丹参片来源于国内18家不同生产企业.乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯.

1.2 混合对照品储备溶液的制备

取丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、丹参酮I、丹参酮IIA这12种对照品适量，精密称定，加少量甲醇超声溶解后，再加入50%甲醇溶解并稀释成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备溶液.

1.3 供试品溶液的制备

取本品10片，除去包衣，研细，称取约1 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，冷却至室温，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得.

1.4 色谱条件

柱温为40 ℃；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0.01～95.00 min，5% A→55% A；95.01～115.00 min，5% A）；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；化合物检测波长如表1所列.人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5.在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱图如图1所示.

图1 对照品和样品的色谱图（1）丹参素钠，（2）原儿茶酸，（3）原儿茶醛，（4）迷迭香酸，（5）丹酚酸B，（6）三七皂苷R1，（7）人参皂苷Rg1，（8）人参皂苷Re，（9）人参皂苷Rb1，（10）人参皂苷Rb3，（11）丹参酮I，（12）丹参酮IIAFig.1 Chromatograms of reference substance and sample

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

分别精密量取“1.2”项下混合对照品储备溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照溶液.吸取上述混合对照溶液10 μL，按“1.3”项下色谱条件测定色谱峰面积.以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数，结果如表1所列.

2.2 精密度

精密量取“1.2”项下混合对照品储备溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照溶液.吸取混合对照溶液10 μL，按“1.3”项下色谱条件，连续进样6次，测定色谱峰峰面积.结果显示，混合对照溶液中丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、丹参酮I、丹参酮IIA的峰面积相对标准偏差（RSD，n=6）分别为0.7%、0.9%、0.8%、0.9%、0.8%、1.2%、1.1%、1.2%、1.1%、1.2%、0.8%、0.9%.结果表明仪器的精密度良好.

2.3 稳定性

精密量取“1.2”项下混合对照品储备溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照溶液.吸取混合对照溶液10 μL，按“1.3”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、18、24 h进样，测定各个色谱峰峰面积.结果显示，混合对照溶液中丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、丹参酮I、丹参酮IIA的峰面积RSD分别为0.8%、0.8%、0.7%、0.9%、0.8%、1.3%、1.3%、1.1%、1.3%、1.1%、0.8%、0.9%.结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好.

2.4 回收率

取同一批次复方丹参片样品3份，每份加入低、中、高3个浓度的对照品溶液适量，按“1.2”项下方法制备，按“1.3”项下色谱条件进行测定，分别计算回收率.结果显示，12种成分的回收率在96.1%～99.8%之间，结果如表2所列.

2.5 样品的含量测定

本次试验42批次复方丹参片，按照“1.2”项下方法制备，按“1.3”项下色谱条件进行测定，部分检测结果如表2所列.结果出现了不同厂家及同一厂家不同批次样品间的含量差异较大的情况，这可能与丹参、三七原药材的质量及提取加工处理等有关.复方丹参片作为治疗冠心病、心绞痛等心脏疾病的基本药物之一，其有效成分含量波动较大，应当引起生产厂家及药品监管等相关部门的重视.

表 2 回收率Table 2 Recovery

3 结论

复方丹参片虽然处方简单，但制剂种类及规格较多，且各生产厂家的原料及工艺水平不一，造成了药品质量参差不齐.《中华人民共和国药典》（一部2020年版）规定了丹参酮ⅡA、丹酚酸B、三七3个项目，但检验是否掺有三七茎叶时还需按照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号2008010）的补充检验方法，整个检验过程不仅耗时耗力，还加大了有机试剂的用量，加重了环境污染.由于复方丹参片含有脂溶性和水溶性成分，因此样品提取时，采用溶剂质量分数为0%、25%、50%、75%、100%的甲醇，超声时间15、30、45 min进行正交试验，发现50%甲醇与30 min提取效果最佳，其他的组合导致脂溶性或水溶性成分提取不充分.本文采用HPLCDAD法测定复方丹参片中12种成分的含量，极大地降低了分析时间，解决了上述弊端，可以提高对复方丹参片的质量控制.