HPLC-DAD法同时测定防脱发类化妆品中6种抗雄激素药物*

刘 丹，马 莹，杨 健,李泽夏琼

(贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004)

头发是人类形象的重要组成部分，脱发会影响患者的心理健康和生活质量。研究表明，脱发人群普遍存在负性情绪、自我效能感及生活质量下降的情况[1]。雄激素性脱发(AGA)是脱发中最常见的类型，在我国，AGA在男性中患病率约为21.3%，在女性中约为6.0%[2]。基于这种情况，防脱发类化妆品在我国拥有相当可观的市场占有率。防脱发类化妆品在最新颁布的《化妆品监督管理条例》中被列为6类特殊化妆品之一，风险程度较高。本文首次建立同时检测防脱发类化妆品中氟他胺、非那雄胺、左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺等6种抗雄激素药物的HPLC-DAD方法，为防脱发类化妆品非法添加检测提供一种新方法，在化妆品技术监管工作中具有一定的应用价值。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

e2695型高效液相色谱仪，配2998型DAD检测器，美国Waters公司；电子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TALBOYS STD MINI型涡旋振荡器，美国Henry Troemner公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TG16-Ⅱ型医用离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2 试 剂

1.2.1 对照品

氟他胺(批号：100598-201302；纯度：99.8%)、非那雄胺(批号：100611-201503；纯度：99.7%)、左炔诺孕酮(批号：100076-201205；纯度：99.2%)、醋酸环丙孕酮(批号：100536-201602；纯度：99.7%)、醋酸氯地孕酮(批号：100011-200702；纯度：100%),中国食品药品检定研究院；度他雄胺(批号：AL200316-12；纯度：99.25%),美国Stanford Chemicals公司。

1.2.2 试 剂

甲醇(色谱纯)，德国Merck公司；甲醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为实验室自制一级水。

1.2.3 基质样品

膏霜基质样品为市售某品牌养发膏，乳液基质样品为市售某品牌洗发乳，水基质样品为市售某品牌育发液，经检测均不含上述6种药物。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡ C18色谱柱(4.6 mm I.D. ×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇:水=72:28；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮为285 nm，其余4种物质为225 nm；光谱扫描范围：200～400 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的配制

精密称取“1.2.1”项下6种对照品各50 mg，分别置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成1000 μg·mL-1的单对照品储备液。精密吸取上述6种储备液各10 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成100 μg·mL-1的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液1 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得5 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备

取膏霜、乳液样品适量混匀，精密称取0.5 g，置15 mL具盖离心管中，加甲醇至10 mL，置涡旋振荡器上涡旋至分散，超声(功率500 W，频率40 kHz)20 min，6000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为样品溶液。精密量取水溶液样品0.5 mL，置15 mL具盖离心管中，加甲醇至10 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性试验

在2.1条件下，6种物质在25 min内出峰，各色谱峰与相邻色谱峰分离度均>1.5，理论塔板数以氟他胺峰计≥10000。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.3.2 检出限和定量限考察

取膏霜、乳液基质样品各5 g，水基质样品5 mL，加甲醇100 mL，混匀，滤过，取续滤液作为稀释溶剂，将混合对照品溶液逐级稀释，并取不同体积进样，记录信噪比为3:1及10:1时的浓度及进样体积，计算检出限和定量限，并按2.2.2条件计算检出浓度和定量浓度。结果6种物质的检出限和定量限在三种基质背景下均相同，具体见表1。

表1 检出限和定量限

2.3.3 线性关系试验

精密吸取混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为2、5、10、20、60、80、100 μg·mL-1的混合标准曲线系列溶液。分别自动进样10 μL，以各组分的浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，结果见表2。结果表明6种物质在各自线性范围内峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表2 线性关系试验结果

2.3.4 仪器精密度试验

分别取混合对照品溶液及混合对照品储备液，作为低浓度和高浓度溶液进行试验。分别按2.1项下色谱条件连续进样6次，计算各物质峰面积的RSD，结果氟他胺、非那雄胺、左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺低浓度溶液峰面积RSD依次为0.26%、0.67%、0.26%、0.17%、0.37%和0.39%，高浓度溶液峰面积RSD依次为0.14%、0.15%、0.18%、0.12%、0.12%和0.16%。结果表明低浓度和高浓度溶液测试时仪器精密度均良好。

2.3.5 重复性及回收率试验

取膏霜、乳液基质样品0.5 g，水基质样品0.5 mL，各12份，分为低浓度和高浓度两组，每组6份；低浓度组每份精密加入混合对照品储备液0.5 mL，高浓度组每份分别精密加入6种物质的单对照品储备液各1 mL，按2.2.2项下的方法分别制备低浓度、高浓度重复性及回收率供试溶液，同时取混合对照品溶液和混合对照品储备液，作为低浓度、高浓度对照溶液，分别按2.1项下色谱条件进样，按外标法计算各物质的含量(μg)，并计算加样回收率及RSD，结果平均加样回收率为97.6%～99.8%，RSD为0.05%～0.97%。从RSD可见重复性良好，详见表3。

表3 重复性及回收率结果

2.3.6 稳定性试验

取膏霜、乳液基质样品0.5 g，水基质样品0.5 mL，各2份，分为低浓度和高浓度两组，按2.3.5项下的方法加样处理，制得稳定性溶液。分别于0、8、16、24、32、40、48小时进行测定，计算各物质峰面积的RSD，结果6种物质在膏霜基质中低浓度RSD为0.16%～1.31%，高浓度RSD为0.21%～0.79%；在乳液基质中低浓度RSD为0.25%～0.73%，高浓度RSD为0.17%～0.45%；在水基质中低浓度RSD为0.15%～0.80%，高浓度RSD为0.20%～0.55%。结果表明3种基质条件下6种物质的低浓度和高浓度溶液均在48 h内稳定。

2.3.7 适用性试验

将2.1中的色谱柱替换为Waters XBridge C18柱和SHIMADZU Shim-pack VP-ODS柱，其它条件不变，按2.3.5项下的方法制备供试溶液，测定两种色谱柱条件下的加样回收率，结果在3种基质中，XBridge柱所测得6种物质平均加样回收率低浓度为96.1%～99.6%，高浓度为94.8%～99.2%；Shim-pack柱所测得6种物质平均加样回收率低浓度为96.0%～99.7%，高浓度为96.7%～99.4%。3种色谱柱间回收率的RSD为0.11～1.69(n=36)。结果表明该方法对不同品牌色谱柱的适用性良好。

2.3.8 样品测试

按2.1～2.2中的方法对市售18批防脱发类产品进行检测，结果均未检出上述6种物质；其中3批样品中疑似检出氟他胺峰，5批样品中疑似检出非那雄胺峰，但经光谱确证为阴性。

3 讨 论

3.1 检测物及检测方法的选择

氟他胺为雄激素受体抑制剂，非那雄胺和度他雄胺均为5α-还原酶抑制剂，左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮和醋酸氯地孕酮为常见的孕激素，均具有较强的雄激素抑制作用，它们的防脱发作用在部分文献中有所报道[3-7]。关于化妆品中上述6种物质的检测方法，现有的文献报道多为LC-MS法同时检测上述物质中的2～3种[8-10]以及HPLC法检测非那雄胺1种成分[11]，尚无HPLC法同时检测化妆品中上述6种物质的报道，本文为首次研究。HPLC是现阶段化妆品中禁限用物质检测最为常规和广泛使用的分析技术[12]，采用HPLC建立化妆品中非法添加物质的检测方法，更加有利于化妆品检验机构的实时监测。

3.2 流动相的选择

本文考察了乙腈-水系统和甲醇-水系统的差异，结果两者均能使6种物质在25 min以内完全分离，但乙腈在2.1色谱条件下出现倒峰，影响左炔诺孕酮出峰，且乙腈毒性略大，成本较高，故选择甲醇-水系统作为流动相。

3.3 取样量的考察

本文考察了膏霜、乳液样品取样量0.1 g、0.5 g、1.0 g时的情况，结果取样1.0 g时，样品在溶剂中较难分散，提取液较难过滤；取样0.5 g时加样回收率满足要求，且较取样0.1 g时检出浓度更低，故选择0.5 g为取样量。

3.4 检测波长的确定

经DAD检测器扫描，氟他胺、非那雄胺、左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺的最大吸收波长依次为227.1 nm、204.7 nm、242.5 nm、284.0 nm、286.4 nm和203.5 nm选择285 nm作为醋酸环丙孕酮和醋酸氯地孕酮的检测波长、225 nm作为其余4种物质的检测波长，可以使各物质的检出限较为平均。6种物质在200～400 nm间的光谱曲线均具有一定的特异性，在用于非法添加检测的常量分析下可满足定性确证的需求。

3.5 适用性说明

本文使用3种品牌的C18柱均能得到良好的分离度和回收率，但流动相的比例需要进行略微调整，以达到各物质色谱峰之间良好的分离。建议选取碳载量较高的色谱柱进行实验。

4 结 论

本文建立了同时检测防脱发类化妆品中非法添加6种抗雄激素类药物的方法。通过单因素实验对色谱柱、流动相、检测波长、取样量等因素进行了考查，最终确定了适应性较强的色谱条件，实现了良好的分离效果。对所建立的分析方法进行的方法学考察，结果表明该方法灵敏度及准确性较高，适用于化妆品中非法添加氟他胺等6种抗雄激素类药物的定性、定量分析，为防脱发类化妆品监管提供了有力的技术支撑。