基于芽孢杆菌固态发酵技术提高广西河池C4F烟叶品质的研究

薛云，宁振兴，苏赞，刘启斌，王敏，毛多斌，龙章德，魏涛

1.广西中烟工业有限责任公司 技术中心，广西 南宁 530004；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

广西河池地区C4F烟叶因杂气重、吸味品质较差等缺点，致使在卷烟叶组配方中的使用率较低。为了提高该地区烟叶利用率，需要对其吸味品质进行改善。已有研究表明利用微生物对不适用烟叶进行处理是改善烟叶品质的重要方式之一[1-3]。在一定条件下，微生物通过自身代谢可以将烟叶中的大分子化合物(如淀粉、蛋白质、果胶和纤维素等)降解为单糖和氨基酸等小分子化合物，这些小分子化合物经过一系列转化，生成醇类、醛类、酸类、酯类和酮类等香味成分，对于提升烟叶吸食品质具有重要价值和意义[4-5]。

郑小嘎[6]筛选得到4株诱香增质效果较好的真菌菌株，该菌株处理过的烟叶化学成分更趋协调，香气质和香气量得分均高于对照组，余味更加舒适，杂气和刺激性减小；胡志忠等[7]利用产香酵母对贵州烟叶进行固态发酵，发现在最佳发酵条件下，新增的多种重要致香物质(包括糠醇、金合欢醇、β-环柠檬醛等)可以有效改善烟叶品质；黄静文等[8]利用短小芽孢杆菌Van35处理烟叶后，能降低烟叶烟碱、蛋白质含量等，显著增加烟香、降低刺激性、醇和烟气，改善卷烟吸味；巩效伟等[9]用产香微生物CXJ-3枯草芽孢杆菌、CXJ-7西姆芽孢杆菌和CXJ-12短小芽孢杆菌及其复合菌剂分别处理梗丝，与对照相比，梗丝的总糖、还原糖和挥发性香气成分的含量均显著提升，其中复合菌剂处理样品的挥发性成分含量提升最为明显，达141.466 μg/g；余玉莎等[10]用产香真菌米根霉对烟叶进行发酵，发现能增加烟叶中部分致香成分的含量。

综上所述，利用微生物固态发酵技术处理烟叶是目前改善烟叶品质的重要方法之一，芽孢杆菌和酵母菌是烟叶固态发酵中的常用菌株[11-13]。目前还未见利用微生物固态发酵技术来改善广西河池C4F烟叶品质的相关报道。鉴于此，本研究拟选取河池C4F烟叶为研究对象，利用前期筛选获得的芽孢杆菌对其进行固态发酵处理，通过单因素试验和响应面试验确定最佳发酵条件，对比分析发酵后烟叶常规化学成分和致香成分的变化，结合感官评吸技术评价发酵后的烟叶吸食品质，为改善广西河池C4F烟叶品质、提升其利用率的研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要试剂：Brij 35溶液(聚乙氧基月桂醚)、二氯异氰尿酸钠，北京百灵威科技有限公司产；硼酸钠，国药集团化学试剂有限公司产；二氯甲烷，天津市凯通化学试剂有限公司产；盐酸，烟台市双双有限公司产。

主要仪器：400 g多功能粉碎机，上海树立仪器仪表有限公司产；KQ-700DE数控超声仪,昆山市超声仪器有限公司产；AA3连续流动分析仪，德国SEAL公司产；同时蒸馏萃取装置，郑州科技玻璃仪器厂产；DLSB-1020低温冷却循环泵，郑州国瑞仪器有限公司产。

实验材料：广西河池地区C4F烟叶，由广西中烟工业有限责任公司技术中心提供，将烟叶粉碎过40目分样筛后制成样品备用。芽孢杆菌ZZ-8(Bacillussp. ZZ-8)，由郑州轻工业大学实验室从河南初烤烟叶中筛选获得并保存。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养从-80 ℃冰箱中取出ZZ-8菌株，转接固体LB培养基，在30 ℃培养箱里培养12 h。挑选较大的菌落，接入30 mL的液体LB培养基中，在30 ℃、180 r/min的条件下培养12 h，获得种子液。以2%的接种量接种于300 mL 液体LB培养基中，在相同条件下培养12～16 h。将菌液以8000 r/min的转速离心10 min，去除上清，将沉淀溶于30 mL无菌水中，重复两次，备用。

1.2.2 烟叶固态发酵单因素试验烤烟烟叶石油醚提取物(包括挥发油、树脂、油脂、脂肪酸、蜡质、类脂物和色素)常用作衡量烟叶品质和香气的重要指标，因此，本文以石油醚提取物质量分数为指标，优化芽孢杆菌ZZ-8发酵广西河池地区C4F烟叶的条件[14-15]。

1)接种量：取50 g烟叶，分别喷洒1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL菌悬液在烟叶上，设置相对湿度为50%，在28 ℃条件下发酵36 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数，每个测试组重复3次，取平均值，并进行显著性分析。

2)发酵温度：取50 g烟叶，将2 mL菌悬液均匀喷洒在烟叶上，设置相对湿度为50%，分别在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃条件下发酵36 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数，每个测试组重复3次，取平均值，并进行显著性分析。

3)发酵时间：取50 g烟叶，将2 mL菌悬液均匀喷洒在烟叶上，设置相对湿度为50%，在28 ℃条件下分别发酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数，每个测试组重复3次，取平均值，并进行显著性分析。

4)相对湿度：取50 g烟叶，将2 mL菌悬液均匀喷洒在烟叶上，分别设置相对湿度为30%、40%、50%、60%和70%，在28 ℃条件下发酵36 h，发酵结束后测定石油醚提取物质量分数，每个测试组重复3次，取平均值，并进行显著性分析。

1.2.3 响应面试验在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心设计方法设计响应面试验，以石油醚提取物质量分数(Y)为考查指标，以接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)及相对湿度(D)为自变量，确定菌株发酵最佳条件。

采用Excel 2016 对实验数据进行统计分析，利用SPSS 17.0 进行显著性分析，利用Design-Expert 10.0对响应面试验设计方案和结果进行分析[16]。

1.2.4 卷烟样品制备取50 g烟叶，以最优条件进行固态发酵，作为实验组；用等量的无菌水替代菌悬液，均匀喷洒在50 g烟叶上，以同样的条件进行发酵，作为对照组。发酵后分别测定烟叶的常规化学成分、致香成分，并将烟叶制成卷烟后进行感官评吸，以明确烟叶固态发酵效果。

1.2.5 常规化学成分检测烟叶中常规化学成分烟碱、氮、还原性糖、淀粉、钾和氯等的含量分别参照烟草行业标准[17-22]进行测定。

1.2.6 致香成分提取及分析用天平称取30 g过40目分样筛的烟末置于1000 mL圆底烧瓶中，加入100 g无水硫酸钠和400 mL纯净水，将其振荡摇匀后放入同时蒸馏萃取装置于60 ℃水浴加热, 2.5 h后得到含有100 mL二氯甲烷的萃取液。对萃取液进行萃取分离，得到中性的萃取液，再加入一定量的无水硫酸钠进行冷藏干燥，静置过夜后蒸馏浓缩样品至1 mL左右，用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行定量分析。烟叶致香成分的化学指标均重复测定3次，计算其平均值和标准差。

GC分析条件：HP-5 MS毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度为240 ℃；载气为99.999% 高纯度氦气；流速为1.0 mL/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0 μL。升温程序：50 ℃(保持4 min)，以3 ℃/min升温到70 ℃(保持5 min)，再以2 ℃/min升温到100 ℃(保持17 min)，然后以2 ℃/min升温到120 ℃(保持10 min)，最后以6 ℃/min升温到280 ℃。

MS分析条件：传输线温度280 ℃；离子源温度280 ℃；四级杆温度150 ℃；电子倍增器电压2.28 kV；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70 eV；溶剂延迟10 min；全扫描检测，扫描质量范围35～500 amu。

1.2.7 卷烟感官评吸方法邀请13位评吸者，每位评吸者在上午的同一时间段分别对卷烟进行评吸，每次抽吸6支卷烟，对每种卷烟必须进行3次评吸，分别从卷烟的香气质、香气量、浓度、刺激性、杂气、劲头、余味7项指标进行打分。感官评吸参照文献[23]进行。

2 结果与分析

2.1 烟叶固态发酵条件优化结果

2.1.1 单因素试验结果接种量、发酵温度、发酵时间、相对湿度对石油醚提取物质量分数的影响如图1所示。由图1a)可知，石油醚提取物质量分数随着芽孢杆菌接种量增加而升高，当接种量为3 mL时，石油醚提取物质量分数达到最大值8.3%，显著高于其他接种量(P<0.05)；之后随着接种量增加呈下降趋势。微生物接种量超过一定值会达到饱和状态，石油醚提取物的质量分数不再随着菌接种量增加明显增加，可能是因为菌种接种量过多，影响菌种生长代谢，进而降低相应产物量，因此最佳接种量为3 mL。由图1b)可知，发酵温度28 ℃，石油醚提取物质量分数最高，达到8.0%；随着温度进一步提高，石油醚提取物质量分数开始下降，可能是温度过高抑制了芽孢杆菌的生长和代谢，因此最佳发酵温度为28 ℃。由图1c)可知，在前36 h内，随着发酵时间的延长，石油醚提取物的质量分数逐渐增大，当发酵36 h时其质量分数达到最大，之后随着时间的延长，石油醚提取物质量分数缓慢下降。发酵时间越长，对烟叶外观和品质的影响越大，应控制适当的发酵时间，最佳发酵时间为36 h。由图1 d)可知，在相对湿度为60%时，石油醚提取物的质量分数达到最大，低于60%时，随着相对湿度的增加，石油醚提取物的质量分数逐渐上升，但在超过60%之后其质量分数呈下降趋势。这是由于发酵烟叶相对湿度低时，会影响酶的活性和芽孢杆菌的生长，随着相对湿度的增加，逐渐达到微生物生长的最佳值；但当烟叶相对湿度过高时，烟叶易结块，影响其散热，有可能产生霉变，不利于芽孢杆菌的生长，影响其代谢，因此烟叶的相对湿度要适量，最佳的发酵相对湿度为60%。

图1 接种量、发酵温度、发酵时间、相对湿度对石油醚提取物质量分数的影响Fig.1 Effects of inoculation amount, fermentation temperature, fermentation time and relative humidity on the mass fraction of petroleum ether extract

2.1.2 响应面试验优化结果响应面试验设计与结果如表1所示。利用Design-Expert 10.0对各因素进行多元回归拟合，得到回归方程：

Y=-169.31+11.63A+9.22B+0.50C+0.72D-

0.075AB-0.023AC+0.015AD-1.042×10-3BC-

7.5×10-3BD+4.17×10-4CD-1.56A2-

0.15B2-5.856×10-3C2-4.683×10-3D2

回归模型方差分析结果如表2所示。由表2可知，该模型的决定系数R2=0.969，说明该方程与实际情况拟合良好，能够准确反映石油醚提取物质量分数与接种量、发酵温度、发酵时间、相对湿度的关系。失拟项P=2.276 6，差异不显著，表明建立的二次多元回归模型能运用于烟叶石油醚提取物质量分数的预测。该回归模型达极显著水平，模型中的A、A2、B2、C2和D2对响应值影响极显著，表明各因素与响应值不是简单的线性关系，二次项与交互项均对结果影响较大。

表1 响应面试验设计与结果Table 1 Design and results of response surface experiment

表2 回归模型方差分析结果Table 2 Variance analysis of regression model

各因素交互作用对石油醚提取物质量分数影响的响应曲面和等高线分别如图2、图3所示。由图2—3可知，接种量与发酵温度、接种量与相对湿度、发酵温度与发酵时间、发酵温度与相对湿度、发酵时间与相对湿度的交互作用较弱，接种量与发酵时间的交互作用显著；根据曲面陡峭程度及等高线密集程度，可以判断出各因素对石油醚提取物质量分数影响程度的排序为A>C>D>B。该结果与表2所示的回归模型方差分析结果一致。

图2 各因素交互作用对石油醚提取物质量分数影响的响应曲面图Fig.2 Response surface diagram of the interaction of various factors on the mass fraction of petroleum ether extract

图3 各因素交互作用对石油醚提取物质量分数影响的等高线Fig.3 Contour line of the influence of the interaction of various factors on the mass fraction of petroleum ether extract

通过响应面分析预测最佳发酵条件为接种量3 mL、发酵温度28.02 ℃、发酵时间36.58 h和相对湿度为61.04%，在此条件下石油醚提取物质量分数为8.94%。为便于实际操作，将发酵条件修正为：接种量3 mL、发酵温度28 ℃、发酵时间36 h和相对湿度为60%，在该条件下进行验证实验，石油醚提取物质量分数为9.01%，与理论预测值接近。

2.2 烟叶固态发酵效果分析结果

2.2.1 常规化学成分分析发酵后烟叶常规化学成分质量分数如表3所示。由表3可知，芽孢杆菌发酵处理后烟叶总糖质量分数由23.10%降低到22.20%，还原糖质量分数由22.19%提高到22.40%，糖碱比由10.23降低至9.45。这可能是因为在发酵过程中芽孢杆菌生长消耗总糖，同时由于自身代谢生成少量还原糖；发酵后烟叶的钾氯比降低，可能会引起烟叶的燃烧性降低。

表3 发酵后烟叶常规化学成分质量分数Table 3 Mass fraction Routine chemical components in fermented tobacco leaves

2.2.2 致香成分分析烟叶致香成分中羰基化合物(酮类)和类脂类对烟叶品质具有重要作用，其中重要香味成分包括：巨豆三烯酮、大马酮、茄酮、二氢大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、糠醇、糠醛、苯乙醛、二氢氧化异氟尔酮、β-紫罗兰酮、金合欢醇、β-环柠檬醛等。

发酵后烟叶中致香成分含量如表4所示。由表4可知，经芽孢杆菌发酵后的烟叶致香成分总含量由170.444 μg/g提高到186.267 μg/g，提高9.0%。其中大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氢大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯等香味成分含量的变化较大，巨豆三烯酮和茄酮是烟叶香气的重要组成部分，能显著增强烟香、改善吸味、调和烟气，并减少刺激感[24]；大马酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯是烟叶香气前体物类胡萝卜素的裂解物，是增加烟香和清新香气的主要成分[3]。新检出的苯甲醛和β-环柠檬醛是2种醛类物质，β-环柠檬醛具有甜香，可以增加烟气浓度和减少烟气刺激性，而苯甲醛具有独特甜味，具有醇和烟气的作用[24]。

表4 发酵后烟叶中致香成分含量Table 4 Content of aroma components in fermented tobacco leaves

蒿洪欣等[25]报道了芽孢杆菌具有降解类胡萝卜素物质的活性，提示了芽孢杆菌具有降解类胡萝卜素物质的代谢途径。本文所使用的菌株ZZ-8也属于芽孢杆菌，并且是从以类胡萝卜素(β-胡萝卜素和叶黄素)为唯一碳源的筛选培养基中获得的，初步分离得到降解β-胡萝卜素和叶黄素相关酶类，基于以上结果初步推测菌株ZZ-8自身能够产生类胡萝卜素降解酶，进而在发酵过程中可以将类胡萝卜素物质转化为大马酮、二氢大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯等致香成分。

2.2.3 卷烟感官评吸结果卷烟感官评吸结果如表5所示。由表5可知，与对照组相比，经菌株发酵后的烟叶香气质提高，香气饱满度增加，刺激性和杂气减少，烟气细腻柔和度得到改善，卷烟余味舒适度提高，评吸分数达到44.6分，比对照组增加1.0分，在一定程度上改善了烟叶的吸食品质。

表5 卷烟感官评吸结果Table 5 Cigarette sensory evaluation results 分

3 结论

本研究以广西河池地区C4F烟叶为研究对象，利用芽孢杆菌ZZ-8对其进行固态发酵处理，通过单因素试验和响应面试验获得最优发酵条件为：接种量为3 mL、发酵温度为28 ℃、发酵时间为36 h、相对湿度为60%。在该条件下发酵，烟叶的石油醚提取物质量分数最高，烟叶总糖质量分数由23.10%降低至22.20%，还原糖质量分数由22.19%提高至22.40%，糖碱比由10.23降低至9.45，产生了苯甲醛和β-环柠檬醛2种新物质，致香成分总含量由170.444 μg/g提高到186.267 μg/g。经感官评吸发现，发酵后烟叶香气质有所增加，刺激性和杂气均降低，烟气细腻柔和，余味更舒适。本文建立的芽孢杆菌固态发酵新技术，可以较好地解决广西河池C4F烟叶存在的杂气重、吸味差等问题，提升其利用率。同时在研究中发现发酵后烟叶大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯等香味物质含量有一定程度的提高，推测芽孢杆菌ZZ-8发酵烟叶时能够产生类胡萝卜素代谢酶类以降解β-胡萝卜素和叶黄素，相关降解酶基因克隆和降解机理将是进一步的研究方向。本文的研究成果对阐明烟叶固态发酵过程中重要香味物质动态变化规律和致香机理具有一定的参考价值。