CD4+/CD8+和自噬蛋白Beclin-1与子宫内膜容受性改变和不孕发生相关性探究

巩海凤 俄洛吉（青海省人民医院产科，西宁 810007）

不孕症指夫妻正常性生活中未避孕，1年后仍未受孕［1］。研究显示，我国不孕症发病率达15%，且呈逐渐上升趋势［2］。子宫内膜容受性指子宫内膜允许囊胚吸附、入侵并改变其间质，使胚胎着床［3］。子宫内膜容受性改变是不孕症的发病机制，并影响其治疗效果，免疫性不孕为常见不孕症类型，体内有关抗体异常增加、促炎因子水平上升而加重生殖系统损伤，导致不孕症发生［4］。子宫内膜可维持女性正常月经与生育功能，其容受性为在一段时间内子宫内膜接受囊胚与胚胎着床的能力［5］。子宫内膜容受性异常可导致机体受孕率降低，是影响不孕症发生的主要因素。如何诊断、评估不孕是目前临床研究重点。CD4+、CD8+是T细胞亚群指标，可调节细胞免疫功能，是反映免疫功能的有效指标。免疫细胞水平和子宫内膜容受性异常是不孕症发生的主要危险因素，临床上两者的关系尚无明确结论［6］。另外，自噬是机体对压力的反应，自噬相关蛋白Beclin-1在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用，但其与不孕症关系的报道较少［7］。本研究通过检测不孕症患者外周血细胞与自噬蛋白Beclin-1表达，探究其与子宫内膜容受性的相关性，为不孕症临床评估与诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象选取2019年2月至2021年4月青海省人民医院收治的137例不孕症患者作为研究对象，年龄26～38岁，平均年龄（30.64±3.48）岁；平均体质量指数（BMI）为（22.19±2.36）kg/m2；不孕时间为1～5年，平均（3.81±1.13）年。纳入标准：①符合《不明原因不孕症诊断与治疗中国专家共识》标准［8］，且经影像学与血清检查确诊为不孕；②育龄女性；③临床资料完整，患者知情同意。排除标准：①因男方原因导致不孕者；②合并恶性肿瘤患者；③子宫畸形患者；④生殖器类疾病患者；⑤输卵管造影异常患者；⑥精神系统疾病患者。另选60例健康女性作为对照，纳入标准：育龄期已生育，且无妇科疾病，年龄25～38岁，平均年龄（30.17±3.54）岁，平均BMI为（22.25±2.24）kg/m2。健康组与不孕组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2 主要试剂与仪器兔抗Beclin-1（ab62557，Abcam公司）；流式细胞仪（美国贝克曼公司，型号CytoFLEX）；高倍显微镜（Leica公司）；阴道彩色多普勒超声诊断仪（GE公司，型号Voluson E8）。

1.2 方法

1.2.1 外周血细胞水平检测抽取研究对象外周静脉血置于抗凝管，离心，分离血细胞与血浆，流式细胞仪检测CD4+、CD8+含量，计算CD4+/CD8+。

1.2.2 免疫组化染色石蜡包埋、切片，烘烤，脱蜡水化，修复抗原，加入过氧化氢阻断过氧化物酶活性，磷酸缓冲液冲洗3次，室温下采用血清封闭，加入兔抗Beclin-1 4℃孵育过夜，洗涤，加入二抗，室温孵育、洗涤，加入链霉亲和素室温放置30 min，洗涤3次，逐步滴加联苯胺染色液，观察免疫标记，洗涤，苏木精复染，脱水，密封，高倍显微镜下观察［9］。切片经两位病理科医师双盲法审片，高倍视野下选取5个视野，计100个细胞，观察显色程度以评估阳性细胞比例与染色强度。阳性细胞计分：阳性细胞数占比不超过10%记为1分，阳性细胞数占比11%～50%记为2分；阳性细胞数占比51%～75%记为3分；阳性细胞数占比超过75%记为4分。染色强度：未染色记为0分；淡黄色记为1分；黄色记为2分；深黄色或褐色记为3分。总分为两者计分乘积，总分超过3分表示阳性，反之为阴性［10］。

1.2.3 子宫内膜容受性检测阴道彩色多普勒超声诊断仪检测血流阻力指数、搏动指数、子宫内膜厚度与容积［11］。

1.3 统计学方法采用SPSS20.0软件分析数据，免疫细胞水平、子宫内膜容受性指标以±s表示，行t检验；Beclin-1阳性率以百分比（%）表示，行χ2检验；Spearman相关性分析探讨CD4+/CD8+和Beclin-1阳性表达与子宫内膜容受性相关指标的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康组与不孕组免疫细胞水平比较不孕组CD4+水平、CD4+/CD8+高于健康组，CD8+水平低于健康组（P＜0.05，表1）。

2.2 健康组与不孕组Beclin-1阳性表达比较健康组Beclin-1阳性表达58例，不孕组阳性表达101例（图1），不孕组阳性率（73.72%）低于健康组（96.67%，P＜0.05，表2）。

2.3 健康组与不孕组子宫内膜容受性指标比较不孕组血流阻力指数、搏动指数高于健康组，子宫内膜厚度与容积低于健康组（P＜0.05，表3）。

表1 健康组与不孕组免疫细胞水平比较（±s）Tab.1 Comparison of immune cell levels between healthy group and infertility group（±s）

表1 健康组与不孕组免疫细胞水平比较（±s）Tab.1 Comparison of immune cell levels between healthy group and infertility group（±s）

Groups Health Infertility t P n 60 137 CD4+（%）33.86±4.61 36.98±5.39 3.901＜0.001 CD8+（%）31.59±5.94 27.34±5.46 4.894＜0.001 CD4+/CD8+1.05±0.35 1.37±0.42 5.166＜0.001

图1 免疫组化染色检测Beclin-1表达（×400）Fig.1 Beclin-1 expression detected by immunohistochemical staining（×400）

表2 健康组与不孕组Beclin-1阳性表达比较［例（%）］Tab.2 Comparison of Beclin-1 positive expression between healthy group and infertility group［n（%）］

表3 健康组与不孕组子宫内膜容受性指标比较（±s）Tab.3 Comparison of endometrial receptivity indexes between healthy group and infertility group（±s）

表3 健康组与不孕组子宫内膜容受性指标比较（±s）Tab.3 Comparison of endometrial receptivity indexes between healthy group and infertility group（±s）

Groups Health Infertility t P n 60 137 Blood flow resistance index/（m·s-1）1.48±0.63 2.18±0.59 7.506＜0.001 Pulsatility index/（m·s-1）0.54±0.03 0.78±0.09 20.146＜0.001 Endometrial thickness/mm 9.86±1.29 7.53±1.51 10.402＜0.001 Endometrial volume/ml 3.98±0.76 3.01±0.62 9.416＜0.001

表4 相关性分析Tab.4 Correlation analysis

2.4 不孕组CD4+/CD8+、Beclin-1与子宫内膜容受性指标相关性分析Spearman相关性分析显示，CD4+/CD8+与血流阻力指数、搏动指数呈正相关，与子宫内膜厚度与容积呈负相关（P＜0.05）；Beclin-1阳性表达与血流阻力指数、搏动指数呈负相关，与子宫内膜厚度与容积呈正相关（P＜0.05，表4）。

3 讨论

不孕症是夫妻双方同居超过1年且不采取避孕措施也未能生育［12］。研究显示，我国目前不孕率达15%，且逐渐上升［13］。多囊卵巢综合征等妇科疾病可导致女性不孕。子宫内膜容受性为子宫内膜对胚胎的接受度，可反映子宫内膜形态与功能变化，临床常从子宫内膜形态、厚度与血管等指标评估其容受性，进而评估子宫环境与机体受孕能力［14-15］。本研究中不孕症患者血流阻力指数与搏动指数高于健康组，子宫内膜厚度与容积低于健康组，提示不孕症患者子宫内膜容受性低于健康女性。

免疫性不孕为抗卵巢抗体阳性等因素导致，免疫细胞在不孕中发挥重要作用［16］。机体正常下，T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群水平处于平衡状态，当受到外界刺激，CD4+可调节抗体产生，参与免疫应答过程，且CD8+T细胞可与CD4+产生拮抗，防止B细胞异常活化，两种细胞比例紊乱代表机体免疫功能异常［17-18］。本研究显示，不孕组CD4+水平、CD4+/CD8+高于健康组，CD8+水平低于对照组，与梁杨焕等［19］结论相似，说明外周血CD4+/CD8+异常上升、CD8+水平下降可能与不孕发生有关，该过程对自身抗体、促炎因子等表达上调具有促进作用，进而引发不孕［20］。Th1、Th2细胞由CD4+分化而成，在细胞与体液免疫中发挥重要作用，CD4+平衡被证实参与输卵管炎症性不孕症发生机制。

自噬为真核细胞常见自噬形式，以形成双膜囊泡自噬体为主要特征，可吞没自体细胞成分，降解入组织后被重新利用，该过程也称Ⅱ型程序性细胞死亡［21］。自噬为细胞动态平衡过程，于心血管疾病、癌症、衰老中发挥重要作用。自噬相关蛋白可调控自噬体形成与成熟，Beclin-1为重要自噬因子。Beclin-1的编码基因位于染色体，其分子量为60 kD，与酵母自噬基因细胞同源，可介导自噬起始，作为启动自噬标志物。Beclin-1可介导自噬体成核，机体若无Beclin-1，其自噬通量被阻断，且异常Beclin-1结构可使自噬体畸形。Beclin-1为单倍型较少肿瘤抑制因子，足量Beclin-1是启动自噬的重要部分［23］。子宫内膜异位症血清、腹膜液中Beclin-1 mRNA表达比正常人群低。本研究中Beclin-1多数位于细胞膜与细胞质，不孕组Beclin-1阳性率低于健康组，与丁莹等［22］结论相符。Beclin-1介导子宫内膜异位症的机制可能为：①Beclin-1表达下调、基因突变或缺失，其介导的细胞自噬行为减少，进而减少自噬依赖性蛋白、细胞器降解与自噬体形成，异位内膜细胞可躲避自噬，于子宫内膜外生长而引发不孕；②Beclin-1表达减少后，成熟自噬体也相对减少，影响细胞凋亡，患者细胞凋亡减少可能导致子宫内膜异位症；③Beclin-1减少与失活对Bcl-2家族部分基因调控失控，降低细胞自噬力与程序性细胞死亡，进而使异位子宫内膜生存。不孕组血流阻力指数、搏动指数高于健康组，其子宫内膜厚度与容积低于健康组，说明不孕患者子宫内膜容受性比正常女性差。相关性分析显示，CD4+/CD8+与血流阻力指数、搏动指数呈正相关，与子宫内膜厚度与容积呈负相关；Beclin-1阳性表达与其相反，提示CD4+/CD8+、Beclin-1水平与子宫内膜容受性变化有一定关联［24］。当发生子宫内膜炎、子宫内膜异位等情况，T细胞参与激活自身免疫系统，细胞自噬行为减少，可影响受精而降低子宫内膜容受性，进而对胚胎着床率有一定影响。

综上，不孕症女性外周血CD4+/CD8+上升，自噬蛋白Beclin-1阳性表达下降，与机体子宫内膜容受性变化和不孕症发生有一定关联。本研究仅从各指标水平方面分析CD4+/CD8+和自噬蛋白Beclin-1与子宫内膜容受性的关系，具体机制需进一步探究。