乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究

陈柔含，韩奕奕，马颖清，刘 洋，丰东升

上海市农产品质量安全中心曁农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708

0 引言

牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的铁结合型大分子糖蛋白，其分子量为78～80 kDa。由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸与赖氨酸，故其等电点在7.8～8.2，是一种呈碱性的蛋白质[1]，主要由动物的乳腺上皮细胞分泌及表达。乳铁蛋白（LF）与铁转运和储存密切相关，且对免疫功能系统的调节具有正向作用，同时拥有广谱抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等强大的生物功能，因此被媒体报道为“奶黄金”。在自然界中，人的母乳中LF的含量较高，在1.0～3.0 mg/mL的范围内[2]，而牛初乳中的含量相对较低。因此商业上很多乳品企业通常会在乳基的婴幼儿配方食品中添加营养强化剂LF，使其营养成分更接近于母乳。国家卫生和计划生育委员会2004年第6号公告首次将LF作为新型食品添加剂，并规定了适用范围，且设定了最大使用量。《GB 14880—2012 食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》于2012年3月30日推行，其中明确指出LF可作为食品营养强化剂，可在乳制品及婴幼儿配方食品中进行强化，并规定其最高使用量不超过1.0 g/kg。市场上也广泛存在含bLF强化剂的调制乳、发酵乳及含乳饮料等产品。

我国目前尚未出台食品中bLF测定相关的国家级标准。2019年天津奶业协会发布了团体标准《T/TDSTIA 006—2019 奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法》，中国食品科学技术学会于2021年颁布了《T/CIFST 006—2021 食品中乳铁蛋白的测定酶联免疫吸附法》，检测方法的空缺和检测结果的不一致性仍是限制bLF作为营养强化剂应用和推广的主要技术瓶颈。同时，据有关的文献报道，测定食品中bLF含量的方法除了上述提及的酶联免疫技术（ELISA）[3～5]和液相色谱（LC）[6～9]，还有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[10]、毛细管电泳技术（HPCE）[11～14]及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[15～17]等。ELISA法尽管步骤简单，但灵敏度偏低、重现性较差，容易出现假阳性。蛋白质的分析常常会用到SDS-PAGE进行条带分离，但操作复杂，耗时久，相邻组分的条带其界面存在混淆不清的现象，难以获得令人满意的重复性。HPCE则是包括电泳分离与色谱光谱交叉的新型液相微分离技术，快速且灵敏，但易受毛细管与电压等条件的限制导致重现性较差；LC法采用不同的前处理方法溶解、除杂、纯化LF，结果准确，重现性较好。据报道，肝素具有已知生物大分子的最高负电荷密度，因此对各种蛋白质（包括LF）具有很高的特异结合能力，但对β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白没有很高的结合亲和力[18]。不少液相方法的前处理提取纯化都是采用肝素亲和柱，简单方便。LC-MS/MS法兼具色谱分离复杂样品的能力与质谱的高选择性、高灵敏度及精确确证等优点，在LF的检测中得到广泛的应用[19]。该法测定bLF基于蛋白质组学的原理，建立在“蛋白-特征肽段”间稳定的转换，通过胰蛋白酶将蛋白质酶解后产物即肽段，通过色谱分离、质谱检测产生的信号，转换信号为肽段浓度，反推计算出蛋白质浓度[20]。

本文拟通过对比高效液相色谱（H i g h Performance Liquid Chromatography，HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC- MS/MS）法两种不同原理的检测方法，测定乳与乳制品中bLF的含量，探讨两种方法差异及优缺点，以期对食品安全国家标准及相关研究人员提供技术参考和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Hi TrapTM Heparin HP肝素亲和柱（1mL），美国Cytiva公司；塑料离心管（50 mL/15 mL），CNW，美国；低蛋白吸附枪头（0.1 mL/1 mL），德国Brand公司；低蛋白吸附离心管（1.5 mL），德国Eppendorf公司；低蛋白吸附进样瓶，德国CNW公司；低蛋白吸附滤膜（0.22 μm），美国CNW公司。

氯化钠（NaCl，≥99%）、磷酸（H3PO4，≥99%）、磷酸氢二钠（Na2HPO4，≥99%）、碳酸氢铵（NH4HCO3，≥99%）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT，≥99%）、碘代乙酰胺（Iodoacetamide，IAA，≥99%），美国默克公司；牛胰蛋白酶（测序级），美国Promega公司；三氟乙酸（CF3CO2H，≥99%）、乙腈（CH3CN，≥99%，色谱纯）、甲酸（HCOOH，≥98%，色谱纯），美国Fluka公司；bLF（≥98%），美国Sigma公司，取0.002 g溶于10 mL水中配制成200 μg/mL标准蛋白储备液；内标肽段VDSAL（13C9，15N）YLGSR，上海吉尔生化有限公司，用水配制成浓度50 μg/mL的内标标准工作液；鸡蛋蛋清蛋白粉、奶粉、调制乳、含乳饮料（市售）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Agilent 1260，配有紫外检测器），美国Agilent公司；超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：超高效液相色谱（Acquity HClass UPLC），美国Waters公司；三重四极杆质谱（Triple QuadTM 6500），美国SCIEX公司；天平（万分之一）、pH计，美国Metteler公司；冷冻离心机（Thermo Heraeus X1R），小型冷冻离心机（Thermo Fresco 21），涡旋振荡器，美国Thermo公司；振荡水浴锅（DRHH-D6），常州丹瑞公司；Millipore超纯水系统，美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC法

（1） 样品提取

固体及半固体样品：称取5 g（精确至0.01 g）试样于烧杯中，加预热过（温度低于50 ℃）的磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L），搅拌溶解样品，分次将样品转移至50 mL容量瓶中，用磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）定容，涡旋混匀后转移至塑料离心管中，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取中间层澄清样液待净化。

液体样品：称取5 g（精确至0.01 g）样品于50 mL塑料离心管中，加入适量磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）混匀，将样品转移至25 mL容量瓶中，分次用磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）将离心管管壁冲洗干净转入容量瓶中，并定容，充分混匀后转入离心管，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取中间层澄清样液待净化。

（2） 样品净化

肝素亲和柱净化前，先加入5.0 mL磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）平衡。随后，准确移取10.0 mL样液，加入肝素柱，控制样液缓慢稳定下滴，避免由于样液流出过快，导致目标物无法和肝素柱有效结合。待液面下降至柱填充物的上平面时，用10.0 mL磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）淋洗杂质，弃去所有液体，并排空柱内液体。紧接着，用5.0 mL磷酸氢二钠（50 mmol/L）-氯化钠（1 mol/L）缓冲溶液对目标物进行洗脱，收集全部流出液，用磷酸氢二钠（50 mmol/L）-氯化钠（1 mol/L）缓冲溶液定容至5.00 mL，过膜，供HPLC检测分析。

（3）标准曲线制备

用磷酸氢二钠（50 mmol/L）-氯化钠（1 mol/L）缓冲溶液逐级稀释定容LF储备液，配制成LF浓度分别为0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.050 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20mg/mL和0.50 mg/mL的标准工作液，供仪器检测。

（4） HPLC条件

采用Agilent-C4 反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent 美国）。流动相A为0.1%（v/v）三氟乙酸水溶液，流动相B为纯乙腈。洗脱梯度如下：0～20 min，85%～15% A；20～22 min，15%～85% A；22～25 min，85% A。流速：1.0 mL/min。进样体积：50 μL；柱温：30 ℃。检测波长：280 nm。

1.3.2 UPLC-MS/MS法

（1）样品溶解

固体样品：称取1 g（精确至0.01 g）样品于50 mL塑料离心管，加入适量温热的水进行溶解，待冷却后，分次将样品转移至25 mL容量瓶，准确定容，充分混匀后转入离心管。

半固体及液体样品：无需溶解处理。

（2） 样品酶解

吸取200 μL样液于1.5 mL离心管中，添加LF同位素内标工作溶液50 μL，再加150 μL100 mmol/L的NH4HCO3溶液，混匀后，加入10 μL二硫苏糖醇（500 mmol/L），混匀。在57 ℃下恒温水浴振荡1 h。取出冷却至室温，加入30 μL 500 mmol/L的碘代乙酰胺，暗处静置0.5 h，加入50 μL 400 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液，涡旋混匀后置于37 ℃恒温水浴酶解至少10 h。取出后加入10 μL甲酸使反应终止，于室温下静置30 min，随后用水定容至1.0 mL，混匀后于12 000 r/min下离心15 min，移取上清液，或过0.22 μm滤膜，供超UPLC-MS/MS检测。

（3） 标准曲线制备

以鸡蛋清蛋白粉作为空白基质，将标准蛋白储备液逐级稀释至1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每个浓度溶液中加入50 μL同位素内标，酶解后供仪器检测。

（4） UPLC-MS/MS条件

色谱条件：采用UPLC peptide BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 ■，Waters，美国）；流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈；流速：0.3 mL/min。洗脱梯度程序：0～0.5 min，95%A；0.5～4.5 min， 95%～30%A；4.5～5.5 min，30% A；5.5～6.0min， 30%～95%A；6.0～8.0 min，95%A。柱温：40 ℃。进样体积：10 μL。

质谱条件：电喷雾ESI源，正离子模式；离子化电压（IS）：5 500 V；喷撞气（CAD）：Medium；气帘气（CUR）：30 psi；温度（TEM）：550 ℃；喷雾气（GS1）：55 psi； 辅助加热气（GS2）：55 psi。质谱检测参数：特征肽段定量离子对m/z 540.6＞595.3，定性离子对m/z 540.6＞319.3，内标肽段定量离子对 m/z 547.5＞602.3，定性离子对m/z 547.5＞319.3。

2 结果与讨论

2.1 准确度和精密度试验结果

选取不同的乳及乳制品作为添加回收的基质。考虑到bLF是营养强化剂，参考了实际样品中目标物的含量范围选择不同的添加浓度水平。其中生鲜乳选择0.005 mg/kg、0.01 mg/kg、0.05 mg/kg三个浓度水平，调制乳和含乳饮料选择0.01 mg/kg、

0.02 mg/kg、0.1 mg/kg，奶粉选择添加三个浓度水平的bLF：0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg，分别加入至不同样品基质中。采用HPLC法和UPLC-MS/MS法进行测定分析，每种浓度测6 次。检测结果见表1。结果表明，两种方法从方法学上均能提供有效、准确的定量结果。其中，HPLC法平均回收率在89.27%～106.83%之间，精密度≤9.71%；UPLC-MS/MS法平均回收率在89.37%～102.77%之间，精密度≤8.45%。

表1 方法准确度和精密度（n=6）

2.2 实际样品测定结果

采用HPLC法和UPLC-MS/MS法分别测定4批次生鲜乳、3批次调制乳、7批次奶粉、3批次巴氏杀菌乳、2批新型巴氏杀菌乳（ESL）和7批次超高温瞬时灭菌乳（UHT）中bLF的含量，每批样品都进行2个平行样的测定，检测结果见表2。试验结果表明，两种方法在定量生鲜乳中bLF含量的差异性较小；在定量调制乳、UHT乳和ESL乳等经高温杀菌过的液态奶中bLF含量存在一定差异，UPLC-MS/MS法定量结果高于HPLC法；在定量奶粉中bLF含量上，HPLC法测定奶粉的结果与标签明示值相似，也就是说，液相方法更接近理论添加值，而UPLC-MS/MS法偏高。这主要原因，归结于在HPLC法中，前处理是采用肝素亲和柱提取、纯化和富集样品中目标物质。肝素亲和柱以肝素作为配体，共价偶联琼脂糖形成固定相填料。肝素是由己糖醛酸与D-葡糖胺残疾相互交联形成的一种硫酸化的糖胺聚糖。由于肝素中大部分基团高度硫化[21]，呈酸性的多阴离子结构，因此阴电密度特别高。肝素可作为一方面可以作为亲和配体，具有族特异性亲和作用，可通过糖苷键与LF发生相互作用；另一方面由于肝素表面的硫酸基团，具备大量负电荷，可与带正电的蛋白质发生离子结合，从而对LF具备高选择性[22]。LF作为一种结构糖蛋白，在适当的缓冲溶液条件下，可以通过亲和层析结合肝素，通过磷酸盐淋洗和盐溶液洗脱，实现LF的分离[23，24]。UPLC-MS/MS法测定bLF则是将LF通过胰蛋白酶酶解为肽段，在数据库中进行肽鉴定进而选择bLF特征性肽段，经过质谱精确确证，实现“蛋白-肽段-蛋白”的定量转换[25]。

表2 不同方法检测乳及乳制品中bLF的含量（n=2）

为考察两个方法差异性来源，选取5 种不同基质，包括生鲜乳、巴氏杀菌乳、ESL乳、UHT乳和奶粉，将HPLC法中过肝素亲和柱后弃去的液体用UPLC-MS/MS法经酶解处理后上机，得到结果如表3所示。结果表明，HPLC法的测定结果与过肝素柱后弃去液的结果加和，约等于UPLC-MS/MS法的测定结果。值得注意的是，未经热加工处理的生鲜乳经肝素柱净化后，弃去液中不含bLF，这表明热加工处理会导致bLF和肝素亲和柱的结合效果。然而，热处理只会破坏bLF中蛋白质空间结构，导致部分活性功能的丧失，但不会破坏蛋白质的氨基酸组成，因此对UPLC-MS/MS检测结果产生影响。

表3 两种方法差异性来源考察（n=2）

3 结论

对比了HPLC法及UPLC-MS/MS法检测乳及乳制品中的bLF，两种方法回收率高、重现性好，均能提供准确、精确的测定结果，满足乳与乳制品中bLF的定量检测需求，但两者方法测定结果具有一定差异性。基于HPLC法测定乳及乳制品中bLF的含量，是通过肝素亲和柱纯化富集，获得非热变性bLF的含量；基于UPLC-MS/MS法测定bLF的含量，通过将大分子蛋白酶解获得肽段，针对特征性肽段，建立内标法测定热变性和非热变性bLF白的含量，不受热处理加工工艺的影响。可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。