多粘类芽孢杆菌LRS-1对辣椒疫霉菌胁迫下根系分泌物的影响

张亮袁红 段良霞 罗雨晴 盛浩

（湖南农业大学资源环境学院，湖南长沙 410128）

根际土壤环境对作物生长具有特殊意义，是作物根系与土壤微生物互作最为密切的微生态圈，该域内各类环境因子、根系分泌物以及微生物群落相互影响、相互制约，对作物生长起到至关重要的作用（Prashar et al.，2014；Finzi et al.，2015）。健康的根际土壤环境中，根系能够分泌和沉淀各类有机物质，为植物生长提供良好的营养来源，并促进根际土壤中微生物数量和群落结构多样性的增长，产生和谐的根系效应（Helmut et al.，2005；Singh &Mukerji，2006；Doornbos et al.，2012）。在土传病害发生严重的根际土壤环境中，受病原菌胁迫影响，植物根系会发生防御性反应，包括根系防卫基因受病原菌的诱导表达以及特异性物质的表达分泌，同时受微生物“群体感应”作用的影响，根际土壤中微生物的群落结构及其数量会发生明显的变化，以求克服或缓解植物根系乃至整个植株的生长障碍（Wu et al.，2009；Albuquerque &Casadevall，2012；Tommassen &Wösten，2015）。

辣椒疫霉病是由辣椒疫霉菌（）引发的世界性土传病害，可导致田间种植或大规模栽培条件下辣椒产量严重损失以及品质显著下降（Hausbeck &Lamour，2004）。多粘类芽孢杆菌LRS-1 由水稻土壤分离筛选获得，前期试验结果表明该菌株对包括辣椒疫霉病和黄瓜疫霉病在内的土传病害具有良好的防控效果（赵旖森 等，2019；张亮 等，2020）。本试验从“疫霉菌—生防菌—根系化感”体系互作的角度对其生防机理予以解析，以期探明多粘类芽孢杆菌LRS-1 对疫霉病害胁迫条件下辣椒根系分泌物影响的作用机理，从而为深入认识和防控该类土传病害的发生及土壤微生态修复提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤、菌株与辣椒品种

试验于2020 年3 月在湖南农业大学资源环境学院教学基地温室进行。供试土壤为第四纪红色黏土母质发育的潴育性水稻土，采集于湖南省农业科学院试验田耕作层。土壤基本理化性质：全氮21.4 g · kg、有机质27.67 g · kg、速效磷17.2 g ·kg、速效钾74 g · kg、pH 值5.2。

供试病原菌为辣椒疫霉菌（）It263，保存于湖南省农业科学院植物保护研究所。供试生防菌为多粘类芽孢杆菌（）LRS-1，保存于湖南农业大学资源环境学院土壤微生物实验室。

辣椒品种为湘椒5 号，采购于长沙新万农种业有限公司。

1.2 培养基

细菌NBY 液体培养基：营养肉汤粉8 g，葡萄糖2.5 g，酵母提取物2 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾2 g，1 mmol · L七水合硫酸镁1 mL，去离子水1 L。真菌培养基PDB：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，去离子水1 L。PDA 培养基：PDB 培养基1 L，琼脂15 g（张亮 等，2020）。

1.3 试验设计

采用盆栽试验，共设3 个处理，包括无病阴性对照（CK）、辣椒疫霉菌处理（PC）和多粘类芽孢杆菌+辣椒疫霉菌处理（LRS1）。每个处理3 次重复，每个重复8 盆（直径15 cm）。

1.4 接种、病原土制备、育苗与盆栽方法

菌株接种：多粘类芽孢杆菌LRS-1 采用泥炭制备法（Khabbaz et al.，2015），即：盆栽前1 d，多粘类芽孢杆菌LRS-1 经NBY 液体培养基于26℃、180 r · min振荡培养48 h，6 000 r · min离心，生理盐水悬浮（1 × 10CFU · mL），最后经辐照灭菌泥炭粉配制为10%（∶）生防泥炭粉（1 × 10CFU · mL），备用。

病原土制备：辣椒疫霉菌It263 经PDA 平板培养7 d 后，于菌落边缘打孔，菌饼直径为0.5 cm，并挑取16 块菌饼于灭菌的培养皿中，加水淹过表面，每隔30 min 换水1 次，第4 次换水后将10 mL洗液注于灭菌的PDB 液体培养基并于26 ℃、180 r ·min黑暗条件下振荡培养120 h，双层灭菌纱布过滤，显微镜下利用血球计数板对游动孢子计数，与过20 目筛的健康水稻土按1∶10（∶）比例混合制备成感病盆栽土。

辣椒育苗：采用育苗盘和无土基质在室内环境下进行辣椒苗培育，每穴播种1～2 粒辣椒种子（表面消毒处理，即75%酒精+无菌水分别清洗2 次，每次30 s），常规管理至三叶一心期。

盆栽试验：每盆加入600 g 感病土，并移入1株根部包裹有生防泥炭粉的辣椒苗（三叶一心期），以不接种的灭菌泥炭粉作为阴性对照。常规管理至第30 天进行采样。

1.5 采样与根系分泌物收集

采样与根系分泌物收集参照赵兰凤等（2013）的离位溶液培养法并略有改进：辣椒植株正常管理至第30 天时，各处理随机选取12 盆，将植株从土壤中拔出，先用自来水冲洗3～5 次，洗掉附着的土粒，之后用超纯水冲洗2～3 次。将辣椒苗放置于5 mg · L百里酚溶液中浸泡3 min，以抑制微生物繁殖，再转入50 mL 5 mmol · L氯化钙溶液中来收集根系分泌物，每个收集瓶均放入4 株。连续收集根系分泌物16 h 后，经定量滤纸过滤除掉脱落的根毛和杂质，在20 ℃下保存备用（徐婉明 等，2010）。

1.6 根系分泌物中有机酸、蛋白质和可溶性糖含量的测定

将收集的根系分泌物原液直接用于有机酸、蛋白质和可溶性糖含量的测定。有机酸含量采用高效液相色谱仪进行测定（袁钒淇 等，2019），蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G-250 比色法（杜欢等，2017），可溶性糖含量测定采用苯酚-硫酸法（刘延吉 等，2006）。

1.7 根系分泌物的GC-MS 分析

吸取15 mL 根系分泌物收集液，加入等体积的乙酸乙酯提取根系分泌物，再将乙酸乙酯提取液过0.45 μm 膜，于旋转蒸发仪中45 ℃减压浓缩至干，加入过0.45 μm 膜的乙酸乙酯2 mL，取1 μL作GC-MS 分析，提取液于湖南农业大学测试中心测定。GC-MS 型号是Finnigam TRACE，离子源EI 70 eV，扫描质量35～335 AMU，毛细管柱：HP-1NNOWAX 柱（30 m × 0.25 mm），进样口温度250 ℃，柱温60 ℃（1 min），以5 ℃ · min程序升温至120 ℃（保持2 min），再以10 ℃ · min程序升温至250 ℃（保持10 min），载气为He，流量为1 mL · min，进样量为1 μL（徐婉明 等，2010）。

1.8 数据处理与分析

数据经Excel 2010 软件统计分析，并采用SAS 9.1 进行方差分析，显著性水平采用Duncan’s 新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理根系分泌物的有机酸、蛋白质与可溶性糖含量

如表1 所示，根系分泌物中有机酸和可溶性糖含量高于蛋白质含量，而有机酸与可溶性糖含量相差不大。不同处理的根系分泌物中有机酸、蛋白质、可溶性糖含量存在差异。就根系分泌物中有机酸含量而言，辣椒疫霉菌处理（PC）有机酸含量最高，较无病阴性对照（CK）增加了80.5%且差异显著，而多粘类芽孢杆菌+辣椒疫霉菌处理（LRS1）的有机酸含量与对照无显著差异，说明辣椒疫霉菌胁迫能够显著增加根系分泌物中有机酸含量，而接种生防菌LRS-1 能显著降低该胁迫对根系有机酸分泌的影响。各处理可溶性糖含量差异显著，具体表现为PC ＞ LRS1 ＞ CK，其中PC 处理较CK 增加了69.3%，较LRS1 处理增加了31.2%，说明辣椒疫霉菌胁迫能显著增加根系分泌物中可溶性糖含量，而接种多粘类芽孢杆菌LRS-1 能缓解该胁迫对根系可溶性糖分泌的影响。与CK 相比，PC 处理和LRS1 处理根系分泌物中蛋白质含量均显著提高，分别提高了26.3%和45.8%，说明疫霉菌胁迫与接种生防菌均能诱导根系提高其抗逆性，这可能与植物获得性系统抗性（SAR）和诱导性系统抗性（ISR）有关。

表1 不同处理根系分泌物有机酸、蛋白质与可溶性糖含量μg · mL-1

2.2 根系分泌物的GC-MS 分析

图2 PC 处理GC-MS 检测结果

图3 LRS1 处理GC-MS 检测结果

如图1～3 所示，GC-MS 鉴定结果显示各处理色谱图柱峰分布情况不同，且有效命名了25 种物质（表2）。检测到的根系分泌物主要为酯类、酸类、胺类、醇类、酮类和烃类化合物等，且以结构相对复杂的酯类、酸类和胺类化合物较多，以直链或支链烷烃为主的烃类和醇类化合物较少。处理间成分比较得知，辣椒根系分泌物的共有化合物为17 种，分别是3，3-二甲基已烷、N，N-二丁基-甲酰胺、3-苯基-2-丙烯酸甲酯、羟基-苯丙酸甲酯、月桂酸甲酯、羟基-苯丙酸甲酯、月桂酸、松香酸、十五烷酸、十六烷、2-羟基环十五烷酮、N-（乙氧甲基）-2 氯代-乙酰胺、乙醇胺、油酰胺、2-乙基对二甲苯、3-正丁烯基苯酞、γ-4-二甲基苯丁醛。

图1 无病阴性对照GC-MS 检测结果

表2 不同处理辣椒根系分泌物成分类型及含量

所有成分中，月桂酸的相对丰度最大，远大于其他化合物，其中CK 的月桂酸含量比其他2 个处理要高，达到了7.40%。与PC 处理相比，CK 与LRS1 处理的共有化合物种类有所减少，未检测到棕榈酸甲酯、1，2，3，5-四甲基苯、苹果酸、2-乙基己醇、2，6-二叔丁基对甲酚、亚油酸乙酯、2，3-二甲基萘、β-谷甾醇等化合物，说明上述分泌物成分可能为疫霉菌逆境下辣椒根系化感的特有成分，也证实了接种多粘类芽孢杆菌LRS-1 能够维系辣椒根系代谢的正常运转，较好地抵御了疫霉菌对辣椒根系化感的负面影响。

3 讨论与结论

在土壤生态环境中根系分泌物会对植物生长产生影响，这种影响使得根系分泌物在其中扮演着两种角色，一方面能够稳定保持土壤生态平衡，积极调整植物与土壤微生物之间的相互作用，另一方面又能作为化感自毒性物质降低土壤的免疫力，诱导病原菌侵染导致植物发病（Huang et al.，2014）。因此，了解根系分泌物对生物逆境胁迫的响应机理对防控疫霉病等土传病害具有重要意义。

本试验结果表明，疫霉菌胁迫条件下辣椒根系分泌物中有机酸和可溶性糖含量显著增加，而接种多粘类芽孢杆菌LRS-1 则对该现象有所缓解。大量研究表明，有机酸与可溶性糖作为根系分泌物中重要组成成分，既有显著的生态功能，又能够刺激病原微生物的生长，加剧土传病害的发生，所以有机酸与可溶性糖的含量一定要在特定的范围内（董艳 等，2016）。Liu 等（2015）研究证明，在特定的浓度范围内苯丙酸对青枯菌的生长有一定的影响，从而发现青枯病发生的重要原因之一可能是烟田连作导致了有机酸含量的增加。郝文雅等（2011）研究发现，西瓜根系分泌物中含量高的糖能够给其致病菌提供营养，而感病西瓜品种可溶性糖含量和种类都很高，能够促进病原菌的繁殖，与之相反，水稻根系分泌物的低糖供给却能降低西瓜对病原菌的营养供给。相关研究已经证实，无论是病原菌引发的植物获得性系统抗性（SAR），还是功能菌诱导植物产生的诱导性系统抗性（ISR），均能不同程度刺激植物分泌大量病程性蛋白类物质，从而提高植物对逆境的防御能力（Pieterse et al.，2014）。本试验显示，接种多粘类芽孢杆菌LRS-1 对辣椒根系分泌物蛋白质类含量具有显著提升效果，这与前人研究结果相符。

根据一些化感作用理论，部分水溶性有机酸、长链脂肪酸、苯甲酸及其衍生物、烃类及其衍生物等低分子有机化合物均具有化感作用，被认为是化感物质（Rice，1990）。本试验发现，虽然不同处理辣椒根系分泌物的化学成分存在一定差异，但是根系分泌物中酸类、醇类、酮类、烃类等化合物均具有化感作用，而烃类、酸类和酯类本身及其次生代谢产物具有一定的化感作用，能够抑制或刺激其他作物生理生化反应以及对土壤中微生物产生影响（张照然 等，2013）。疫霉菌胁迫下辣椒化合物成分种类较对照明显增多，并检测到诸如棕榈酸甲酯、1，2，3，5-四甲基苯、苹果酸、2-乙基己醇、2，6-二叔丁基对甲酚、亚油酸乙酯、2，3-二甲基萘和β-谷甾醇等特异性化合物成分，接种多粘类芽孢杆菌使得无病阴性对照与LRS1 处理间的化合物种类及含量差异不大，而3-苯基-2-丙烯酸甲酯等化合物在接种了LRS-1 处理的辣椒根系分泌物中相对含量最高，且明显高于对照和PC 处理，疫霉菌对辣椒根系化感作用的胁迫影响得到有效抑制。

综上，本试验不仅揭示了疫霉菌胁迫环境下生防菌对寄主植物根系化感胁迫的抑制效应，完善了多粘类芽孢杆菌LRS-1 防治辣椒疫霉病等土传病害的作用机理，也为土壤健康生物防控提供了必要的理论参考依据。