自毒胁迫对黄瓜砧穗种子萌发和抗氧化特性的影响

肖雪梅 马 宁 李 菊 王 瑞 胡琳莉 武 玥 郁继华*

（1 甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730070；2 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃兰州 730070）

黄瓜（L.）是设施栽培的主要蔬菜种类之一，随着连作年限的增加，生产上出现品质下降、产量降低、病虫害加重等连作障碍问题。前人研究表明，作物根系分泌的自毒物质对其自身的毒害作用是引起连作障碍的主要原因之一（喻景权和杜尧舜，2000；Huang et al.，2013）。植物自身释放的化感物质对同种或同科植物产生的生长抑制效应称为自毒现象（Rice &Kozlowski，2013；陈锋等，2017）。黄瓜根系可以分泌包括苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸、肉桂酸和苯丙酸在内的11 种酚酸类自毒物质（Yu &Matsui，1994），其中肉桂酸是主要的自毒物质，常作为外源物质来模拟自毒胁迫（Ye et al.，2006；Bu et al.，2018）。这些自毒物质通过影响黄瓜种子萌发和胚根生长、幼苗的离子吸收和光合作用，抑制黄瓜生长（Yu &Matsui，1997；Yu et al.，2003；Bu et al.，2016）；还可引起根系氧化胁迫，促进枯萎病的发生（Ye et al.，2006）；抑制细胞有丝分裂和细胞周期相关基因的表达（Zhang et al.，2009）。因此，提升黄瓜对自毒胁迫的耐受性可一定程度增强其抵御连作障碍的能力。

通过嫁接换根措施可有效提高蔬菜作物的抗逆性，减轻连作障碍的产生。李玉洪等（2012）发现嫁接能提高苦瓜对枯萎病、蔓枯病、白粉病等病害的抗性，解决苦瓜生产中的连作障碍问题；适宜的砧木嫁接可提高西瓜（Ning et al.，2013）和茄子（陈绍莉 等，2010；Chen et al.，2011）幼苗对自毒物质的耐受性，增强其对土传病害的抗性。甘肃农业大学蔬菜逆境生理研究团队前期研究采用二代转录组测序技术明确了黑籽南瓜（Bouché）嫁接通过调节光合作用、碳氮代谢途径中关键基因的上调，增强黄瓜植株对自毒胁迫的耐受性（Xiao et al.，2020）。Ding 等（2007）研究证实黄瓜与黑籽南瓜幼苗的根系生长对肉桂酸处理表现出不同的响应，其中黄瓜根系中活性氧积累，膜脂过氧化程度加重，生物膜H-ATPase 活性降低，甚至根系活力丧失，而在黑籽南瓜中则没有这种变化。黑籽南瓜这种较强的适应性是否在发芽期就表现出来尚未得到证实，黄瓜、黑籽南瓜种子萌发和胚根生长对肉桂酸的响应差异及相关的生理机制也尚不明确。因此，本试验以肉桂酸为外源物质模拟自毒胁迫，探究黑籽南瓜和黄瓜种子萌发对自毒胁迫的响应是否存在差异及其潜在的生理代谢和基因调控机制，以期进一步从理论上说明黄瓜自毒作用和调控机理，为科学防治黄瓜连作障碍提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以新春4 号黄瓜和黑籽南瓜种子为试验材料。供试种子购买于甘肃省农业科学院种子市场。

1.2 试验设计

试验于2020 年9—12 月在甘肃农业大学园艺学院设施园艺实验室进行。选取健壮饱满、形态一致的黄瓜和黑籽南瓜种子，经温汤浸种后将种子均匀摆放于铺有两层滤纸的培养皿（直径9 cm）中，黄瓜种子每皿30 粒，黑籽南瓜种子每皿20 粒。预试验结果表明0.25 mmol · L是黄瓜种子萌发的中度肉桂酸胁迫浓度，因此本试验向培养皿滴加0.25 mmol · L肉桂酸（CA）溶液浸湿滤纸，以滴加等量蒸馏水为对照（CK），共4 个处理。每处理3 次重复，每个重复10 皿，置于人工气候箱在28 ℃黑暗条件下催芽。催芽期间每天补充适量的蒸馏水或0.25 mmol · L肉桂酸溶液。发芽标准为种皮裂开、胚根露白，处理后2～5 d 每天记录发芽种子数，计算发芽率。前期试验结果表明黄瓜、黑籽南瓜种子萌发的起始时间分别为8 h 和32 h，发芽最快时间分别为11 h 和35 h，因此分别于黄瓜种子萌发的0、8、11、24、48 h 和黑籽南瓜种子萌发的0、32、35、48、72 h 取整株芽苗，每个重复取2 皿。将样品用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干水分，液氮处理后，于-80 ℃保存，用于测定活性氧、丙二醛含量和抗氧化酶活性、基因表达量等指标。分别于黄瓜催芽5 d 和黑籽南瓜催芽7 d 收集胚根，测定芽苗根系形态，每个重复取5 株。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 种子发芽指标

发芽率=萌发种子数/供试种子总数× 100%

芽苗根系形态采用WinPHIZO BASIC 2005 根系分析系统测定，记录根系的总根长、根表面积、根体积和根尖数等指标。

1.3.2 活性氧和丙二醛含量 参照Hu 等（2012）的方法，过氧化氢（HO）含量用硫酸钛法测定，超氧阴离子（O）产生速率用羟胺氧化反应法测定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法测定。

1.3.3 抗氧化酶活性 根据Gossett 等（1994）的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）还原法测定，过氧化氢酶（CAT）活性采用过氧化氢分光光度法测定，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性采用抗坏血酸紫外吸收法测定，谷胱甘肽还原酶（GR）活性采用NADPH 氧化法测定。

1.3.4 抗氧化酶基因的相对表达量 抗氧化酶基因-、-、、、、表达量采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法测定（Zhao et al.，2017）。取样时间为黄瓜发芽8 h和黑籽南瓜发芽32 h。

总RNA 采 用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）试剂盒〔宝生物工程（大连）有限公司〕提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，并采用NanoDrop 2000 检测RNA 浓度和纯度。采用PrimeScriptRT Master Mix（TaKaRa）试剂盒〔宝生物工程（大连）有限公司〕将RNA 反转录为cDNA。依据TaKaRa公司的SYBR System操作手册，于LightCycler 96 实时荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏）上，采用两步法进行PCR 扩增。基因特异性引物序列见表1，以基因为内参。根据得到的值，采用2方法计算目的基因的相对表达量。

表1 基因及其引物信息

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS 软件进行最小显著性差异法（LSD）分析，显著水平＜0.05；采用Microsoft Excel 2010 作图。

2 结果与分析

2.1 肉桂酸对黄瓜砧穗种子发芽率和胚根形态的影响

由表2 可知，黄瓜和黑籽南瓜种子萌发对肉桂酸处理的响应不同。0.25 mmol · L肉桂酸处理可显著抑制黄瓜种子的萌发，发芽率降低了7.8 百分点；而黑籽南瓜种子发芽率却比对照略有升高，但未达到显著水平。表明黑籽南瓜种子萌发对自毒胁迫的耐受性高于黄瓜。

表2 肉桂酸处理对黄瓜和黑籽南瓜种子发芽率和胚根形态的影响

黄瓜和黑籽南瓜芽苗胚根形态均不同程度受到肉桂酸的抑制。其中，黄瓜胚根的总根长、根表面积、根体积和根尖数均比对照显著下降，分别降低

了28.1%、22.2%、14.9%和46.6%；而黑籽南瓜仅根表面积显著低于对照，降幅为17.2%，总根长、根体积和根尖数均与对照无显著差异。另外，无论有无肉桂酸胁迫，黑籽南瓜胚根各形态指标均高于黄瓜，表明黑籽南瓜具有更发达的根系，可能是其对肉桂酸耐受性较高的原因之一。

2.2 肉桂酸对黄瓜砧穗种子萌发过程中活性氧和丙二醛含量的影响

如图1 所示，黄瓜和黑籽南瓜种子中活性氧的积累对肉桂酸胁迫呈现不同的响应水平。随着发芽时间的延长，黄瓜种子的HO含量呈不断升高趋势，O产生速率先升高后降低，且在发芽的各个时期肉桂酸处理下的含量均显著高于对照。而黑籽南瓜种子中HO含量和O-.产生速率均随发芽时间的推进而呈增加趋势，但HO含量仅在发芽48 h 和72 h 显著高于对照，增幅分别为10.4%和36.5%，O产生速率始终与对照无显著差异。表明在同浓度肉桂酸胁迫下，黑籽南瓜比黄瓜积累较少的活性氧自由基。随着发芽时间的延长，黄瓜种子中MDA 含量在肉桂酸处理下不断积累，在发芽48 h 时显著高于对照，增加了26.2%；而黑籽南瓜种子中的MDA 含量在萌发过程中均与对照无显著差异，且在发芽72 h 时骤降。

图1 肉桂酸处理对黄瓜和黑籽南瓜种子萌发过程中H2O2 含量、产生速率和MDA 含量的影响

2.3 肉桂酸对黄瓜砧穗种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响

由图2 可知，随着发芽时间的推进，黄瓜种子的SOD、CAT、APX 和GR 活性均呈现先升后降的变化趋势，APX 活性相比发芽初期有升高趋势，并且肉桂酸处理的酶活性均先高于对照而后低于对照，但不同的酶活性出现的拐点不同。SOD和APX 活性均在发芽8 h 时显著高于对照，而在发芽24 h 和48 h 时显著低于对照，其中，48 h 时分别比对照降低了26.0%和65.2%；CAT 活性除发芽8 h 时显著高于对照外，其余时间点均显著低于对照，在发芽11、24 h 和48 h 时分别比对照降低了11.5%、34.4%和33.3%；而GR 活性仅在发芽24 h 和48 h 时显著低于对照，分别降低44.6%和26.7%。黑籽南瓜抗氧化酶活性对肉桂酸胁迫表现出不同的响应水平。SOD、CAT 和GR 活性均在种子萌发过程的前期升高，后期降低，最终与对照无显著差异，其中SOD 活性分别在发芽32、35 h 和48 h 时显著高于对照，CAT 活性仅在发芽35 h 时显著高于对照，GR 活性在发芽35 h 和48 h 时显著高于对照。APX 活性在发芽的各个时期均受到肉桂酸的显著影响，分别在发芽32、35、48 h 和72 h 时高于对照15.4%、14.3%、55.9%和118.5%。

图2 肉桂酸处理对黄瓜和黑籽南瓜种子萌发过程中SOD、CAT、APX 和GR 活性的影响

2.4 肉桂酸对黄瓜砧穗种子萌发过程中抗氧化酶基因表达量的影响

如图3 所示，除基因外，其他基因表达量在黄瓜种子遭受肉桂酸胁迫后下调，而在黑籽南瓜种子中上调。与对照相比，黄瓜种子萌发过程中的-、-、、和分别下调95%、73%、70%、91%和89%，而黑籽南瓜种子萌发过程中这5 个基因分别上调148%、272%、148%、199%和272%。然而，表现出相反的变化，其在黄瓜种子萌发过程中基因表达量比对照升高了60%，而在黑籽南瓜中降低了93%。

图3 肉桂酸处理对黄瓜、黑籽南瓜种子萌发过程中抗氧化酶基因表达量的影响

3 讨论

种子萌发是植物生命周期中的关键环节，对植物生长发育至关重要。蔬菜作物种子能否正常萌发与出苗率高低直接影响后期的作物产量和品质。本试验结果显示0.25 mmol · L肉桂酸处理显著抑制了黄瓜的发芽，而黑籽南瓜的发芽未受到显著影响，甚至稍有促进。化感物质抑制植物种子萌发的研究已在多种作物中被报道，如莴苣、萝卜和生姜 等（Butcko &Jensen，2002；Han et al.，2008；Yuan et al.，2012）。此外，本试验中初生芽苗的根系发育也受到肉桂酸处理不同程度的抑制，且黄瓜的抑制作用更大。因此，证实了种子萌发阶段的黑籽南瓜比黄瓜对自毒胁迫的耐受性更强。

自毒物质会作用于幼胚细胞，破坏细胞结构，进而影响植物种子萌发。其最直接的结果就是导致种子中电解质的外渗，丙二醛含量的积累，破坏细胞膜结构的完整性。Bu 等（2016，2018）研究发现，肉桂酸的衍生物苯丙酸通过破坏黄瓜种子细胞膜的完整性，引起电解液渗透率增加和丙二醛含量升高，从而抑制其正常的萌发。同样的研究结果在甜瓜植株水浸液对其种子萌发的影响中被证实（Zhang et al.，2020）。本试验发现随着种子萌发时间的推进，黄瓜种子中MDA 含量逐渐增加，在发芽48 h时显著高于对照，而黑籽南瓜始终与对照差异不显著。表明黑籽南瓜遭受肉桂酸伤害的程度较轻。相似的结果在黄瓜、黑籽南瓜幼苗期对肉桂酸胁迫的响应研究中亦被报道（Ye et al.，2006）。活性氧作为重要的信号分子，在种子萌发以及植物抗逆性方面具有重要的调控作用。如果细胞内积累过多的活性氧则会破坏细胞膜以及细胞内大分子物质，改变调节细胞生物活性所必需的氧化还原内稳态，影响植物种子萌发以及生长发育（Pergo et al.，2011）。已有研究表明，作为非生物胁迫的一种，自毒作用能影响植物种子萌发过程中活性氧的产生与清除，进而调控植物种子萌发（Bu et al.，2018）。正常条件下活性氧的产生与清除处于动态平衡中，但受到自毒胁迫时，这种平衡关系被打破，种子萌发就会受到抑制。本试验结果表明，肉桂酸处理可显著促进黄瓜种子HO和O-.的积累，且随着萌发时间的延长积累量增加。而黑籽南瓜仅在种子萌发后期显著促进HO的积累。说明黑籽南瓜遭受的氧化损伤程度较黄瓜轻。

植物在长期的进化过程中形成了一套自我防御体系，在遭遇逆境时可清除过量的活性氧分子，以维持正常的生命活动。有关自毒胁迫对植物抗氧化系统的影响出现两种不同的观点，有的报道称SOD、POD、CAT、APX、GR 活性在自毒物质处理下升高（Bai et al.，2009；Li et al.，2011）；另有一些研究结果显示，自毒胁迫引起这些抗氧化酶活性下降（Bu et al.，2016）。本试验结果表明，肉桂酸处理下的黄瓜SOD、CAT、APX 和GR 活性随萌发时间的推进均呈现先升高后下降的趋势，但发芽后期黄瓜的抗氧化酶活性低于对照，在发芽48 h 分别比对照降低了26.0%、33.3%、65.2%和26.7%；而黑籽南瓜的抗氧化酶活性高于或接近于对照。分析其原因，初期抗氧化酶活性的升高可能是植物遭受逆境胁迫出现的应激反应，随着胁迫时间的延长，酶系统遭受破坏，导致酶活性下降。黄瓜、黑籽南瓜种子中的抗氧化酶基因的表达结果表明，肉桂酸处理可引起-、-、、和基因在黄瓜中的下调和黑籽南瓜中的上调。类似的结果在Li 等（2014）的研究中也有报道，该研究发现黑籽南瓜嫁接通过上调抗氧化酶基因的表达提高黄瓜对高温和低温的适应性。本试验结果进一步从分子水平论证了黑籽南瓜对肉桂酸耐受性高于黄瓜的原因。

4 结论

肉桂酸处理可显著抑制黄瓜的种子萌发和胚根生长，而对黑籽南瓜几乎没有影响。此外，自毒胁迫引起黄瓜丙二醛和活性氧的过度积累，而对黑籽南瓜影响不大。这可能是由于黑籽南瓜具有较发达的根系，抗氧化酶活性的升高和抗氧化酶基因表达的上调，增强了其对活性氧的清除能力，维持了生物膜的稳定性。