响应面法优化耙耙柑皮果胶超声辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

叶群丽，冯 可，梁大伟，何靖柳，章 斌

(雅安职业技术学院药学与检验学院，四川 雅安 625000)

果胶是一类结构复杂的天然多糖，可作为增稠剂、胶凝剂和乳化剂等添加剂应用于食品工业；果胶也是水溶性膳食纤维，对腹泻、糖尿病和肥胖等病症有较好的疗效；果胶还具有抗辐射、抗氧化、抗癌及抗菌等功能[1-3]。目前，果胶的提取方法主要有酸法、盐析法、离子交换树脂法、酶法、微波辅助法及超声辅助法等[4-7]。耙耙柑皮为食品工业废弃物，从中提取果胶，既丰富了果胶的原料，又提升了耙耙柑皮的附加值。鉴于此，作者以四川省蒲江县特产耙耙柑皮为原料，采用超声协同水浴振荡辅助酸法提取耙耙柑皮果胶，通过单因素实验和响应面法优化提取工艺，并研究耙耙柑皮果胶的抗氧化活性，为耙耙柑皮资源的综合利用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜耙耙柑，购于雅安市水果市场。耙耙柑皮切块，煮沸，漂洗，干燥，粉碎，密封，备用[6]。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、盐酸、抗坏血酸(VC)、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢(H2O2)、焦性没食子酸等均为分析纯。

SMF-2002型磨粉机，浙江苏泊尔股份有限公司；DHG-9240AT型电热鼓风干燥箱，上海丙林电子科技有限公司；AUW-120D型电子天平，岛津菲律宾工厂；KQ-5200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；PHS-3C型雷磁酸度计，上海精科仪器厂；SHA-B型数显水浴恒温振荡器，常州金坛精达仪器制造有限公司；RE-2000B型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；KDC-1044型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司。

1.2 耙耙柑皮果胶的提取

称取耙耙柑皮粉末1.000 0 g，加入蒸馏水溶解，混匀，用盐酸调节pH值，超声后水浴振荡，离心；再进行二次提取，合并滤液，旋蒸浓缩，醇沉析出果胶，真空干燥。按式(1)计算果胶提取率[6]：

(1)

1.3 提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

以超声时间20 min、超声温度60 ℃、液料比40∶1(mL∶g，下同)、pH值 2.0、振荡时间20 min、振荡温度90 ℃为基础条件，采用单因素实验考察超声时间(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、超声温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、液料比(30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1)、pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)、振荡时间(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、振荡温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)[6]对耙耙柑皮果胶提取率的影响。

1.3.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原则，选择对果胶提取率影响较大的pH值(A)、液料比(B)、超声温度(C)为变量，以果胶提取率为响应值，进一步优化提取工艺，因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

1.4 耙耙柑皮果胶的抗氧化活性评价

1.4.1 对DPPH自由基清除能力的测定

将耙耙柑皮果胶配制成一系列不同浓度的样品溶液。分别取样品溶液2.0 mL于棕色具塞试管中，加入0.2 mmol·L-1DPPH自由基乙醇溶液2.0 mL，摇匀后，于暗室放置1 h，测定517 nm处吸光度(A样品)[8-10]；以2.0 mL样品溶液与2.0 mL无水乙醇的混合溶液为对照(A对照)，以DPPH自由基乙醇溶液为空白(A空白)[8-10]。以VC为阳性对照。按式(2)计算耙耙柑皮果胶对DPPH自由基的清除率[8-10]：

(2)

(3)

1.4.3 对·OH清除能力的测定

将耙耙柑皮果胶配制成一系列不同浓度的样品溶液。分别取样品溶液2.0 mL于棕色具塞试管中，加入2.0 mmol·L-1FeSO4溶液2.0 mL、2.0 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液2.0 mL、0.03%H2O2溶液0.1 mL，振荡摇匀，于37 ℃下避光保温35 min，测定510 nm处吸光度(A样品)；以蒸馏水代替样品溶液为对照(A对照)[8-10]。以VC为阳性对照。按式(4)计算耙耙柑皮果胶对·OH的清除率：

(4)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图1)

图1 超声时间对耙耙柑皮果胶提取率的影响

由图1可知，随着超声时间的延长，耙耙柑皮果胶提取率先升高后缓慢降低，当超声时间为20 min时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的超声时间为20 min。

2.1.2 超声温度对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图2)

由图2可知，随着超声温度的升高，耙耙柑皮果胶提取率先升高后降低，当超声温度为60 ℃时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的超声温度为60 ℃。

图2 超声温度对耙耙柑皮果胶提取率的影响

2.1.3 液料比对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图3)

由图3可知，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，耙耙柑皮果胶提取率先升高后迅速降低，当液料比为40∶1时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的液料比为40∶1。

图3 液料比对耙耙柑皮果胶提取率的影响

2.1.4 pH值对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图4)

图4 pH值对耙耙柑皮果胶提取率的影响

由图4可知，随着提取液pH值的增大，耙耙柑皮果胶提取率先升高后迅速降低，当提取液pH值为2.0时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的pH值为2.0。

2.1.5 振荡时间对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图5)

由图5可知，随着振荡时间的延长，耙耙柑皮果胶提取率先升高后缓慢降低，当振荡时间为20 min时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的振荡时间为20 min。

图5 振荡时间对耙耙柑皮果胶提取率的影响

2.1.6 振荡温度对耙耙柑皮果胶提取率的影响(图6)

图6 振荡温度对耙耙柑皮果胶提取率的影响

由图6可知，随着振荡温度的升高，耙耙柑皮果胶提取率逐渐升高，当振荡温度为90 ℃时，果胶提取率达到最高。故，提取耙耙柑皮果胶适宜的振荡温度为90 ℃。

2.2 响应面实验优化提取工艺

2.2.1 响应面实验结果(表2)

表2 响应面实验结果

2.2.2 回归模型的建立与方差分析[11-12]

采用Design-Expert 10.0.8软件对所得数据进行二次多项回归拟合，建立模型方程为：Y=28.38-1.96A-0.6362B-0.175C-0.7375AB-0.24AC+0.3BC-4.54A2-1.89B2-1.13C2。

回归模型的方差分析见表3。

表3 回归模型的方差分析

2.2.3 响应面分析

3D响应面图及等高线图可以直观地反映pH值、液料比、超声温度两两交互作用与响应值果胶提取率的关系。各因素交互作用对耙耙柑皮果胶提取率影响的响应面图及等高线图如图7所示。

响应曲面越陡峭表示交互作用越大，反之则交互作用越小。由图7可知，响应曲面陡峭程度为AB>AC>BC，说明AB的交互作用较AC和BC更显著，即pH值与液料比的交互作用对果胶提取率的影响较大[11-12]。上述分析与表3的方差分析结果一致。

图7 各因素交互作用对耙耙柑皮果胶提取率影响的响应面图及等高线图

2.3 最佳工艺的确定及验证

采用Design-Expert 软件优化功能，通过模型预测耙耙柑皮果胶的最佳提取工艺条件为：pH值1.90、液料比39.33∶1、超声温度59.27 ℃，果胶提取率的理论值为28.63%。考虑到实际操作，修正最佳提取工艺条件为：pH值 2.0、液料比40∶1、超声温度60 ℃，在此条件下进行3次平行实验，果胶平均提取率为28.42%。

2.4 耙耙柑皮果胶的抗氧化活性

2.4.1 对DPPH自由基的清除率(图8)

图8 耙耙柑皮果胶对DPPH自由基的清除率

由图8可知，耙耙柑皮果胶和VC对DPPH自由基均有清除作用。VC在较低浓度0.2 mg·mL-1时，对DPPH自由基的清除率达95.5%，随着浓度的增大，VC对DPPH自由基的清除率始终保持在95%左右，表现出较强的抗氧化能力；耙耙柑皮果胶对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大缓慢升高，当浓度为2.0 mg·mL-1时，清除率达到43.9%。表明，耙耙柑皮果胶具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力显著低于VC。

图9 耙耙柑皮果胶对的清除率 scavenging rate of pectin from Papagan peels

2.4.3 对·OH的清除率(图10)

图10 耙耙柑皮果胶对·OH的清除率

由图10可知，耙耙柑皮果胶和VC对·OH均有清除作用。VC浓度为0.8 mg·mL-1时，对·OH的清除率为70.0%，之后继续增大浓度，清除率变化不大；耙耙柑皮果胶对·OH的清除率随着浓度的增大缓慢升高，当浓度为2.0 mg·mL-1时，对·OH的清除率达到35.0%。表明，耙耙柑皮果胶具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力显著低于VC。

3 结论