人参果果汁分段酶解提取工艺优化

杜 琨

(武警工程大学 装备管理与保障学院，陕西 西安 710086)

0 引言

【研究意义】人参果又名长寿果，原产于南美洲。人参果是一种高营养价值水果，口感清甜多汁，果实中富含蛋白质、维生素C和多种微量元素，而脂肪和糖分含量则相对较低[1-2]。由于人参果的硒含量远高于一般水果和蔬菜，因此被誉为生命火种、抗癌之王[3]。相关研究表明，人参果中含有多糖、生物碱及糖苷等活性成分，能够帮助增强机体免疫力，发挥降血脂、抗肿瘤和延缓衰老等功效，具有独特的食用和药用价值[4-5]。自20世纪80年代引入我国后，人参果的种植规模和产量逐年增加，国内人参果的适栽区主要分布在云南、甘肃及青海等地。人参果生长季节性强，收获期短，加上果实含水量大，采后不耐储存，极易腐败变质，造成浪费[6]。因此，开展人参果深度开发利用研究，探究提高人参果出汁率的工艺条件，对提高其市场附加值，促进农民增收具有重要现实意义。【前人研究进展】苏凤贤等[7]运用响应面法和灰色关联分析建立相应的回归模型，优化果胶酶影响人参果出汁率的工艺参数。近年来，以人参果为原材料制备的新型果汁饮品，不仅营养价值丰富，还兼具特有的果香和风味，备受消费者青睐[8-9]。但在果汁加工过程中，鲜果出汁率低，原材料损失严重，导致生产成本进一步增加。目前，常见的果汁制备技术有压榨法和生物酶解法等。生物酶解法是利用酶的水解作用破坏植物的细胞壁结构，使细胞内和植物组织中的汁液释放出来[10]。研究证实不同酶制剂的组合和协同使用，可进一步增大作用范围，显著提高鲜果出汁率[11-12]。程红等[13]采用复合酶制剂法对蓝莓果汁提取工艺进行优化，确定其最佳工艺：果胶酶∶纤维素酶为3∶1，酶解温度为50℃，酶解时间180 min，在此条件下蓝莓果汁的出汁率为73.37%。纤维素酶和半纤维素酶能有效分解水果中的纤维素和半纤维素，二者同时使用具有协同增效作用，且添加半纤维素酶还能大大降低纤维素酶的用量[14]。添加木瓜蛋白酶能有效分解植物组织的蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解N-端具有2个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键，从而提高出汁率[15]。【研究切入点】目前对提高人参果出汁率的研究较少，且大都采用单一酶解法。由于人参果的细胞壁是由纤维素、半纤维素、亲水性果胶和少量结构蛋白构成的复杂网状结构，要提高人参果的出汁率，必须充分破坏细胞壁的结构组成。然而目前鲜见类似的研究报道。【拟解决的关键问题】采用单因素试验研究果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶不同添加量及其在不同温度、pH及酶解时间条件下人参果的出汁率，并在此基础上采用分段酶解法对人参果汁的提取工艺进行优化，考察不同酶解体系对人参果出汁率的影响，旨在提高鲜果的出汁率，为人参果果汁的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人参果 产自甘肃威武天梯山，市购。

1.1.2 试剂 果胶酶，上海源叶生物科技有限公司；纤维素酶、半纤维素酶，北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他化学试剂，均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备 PL602E电子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；SP902S破壁机，苏泊尔电器；HWSY II-K电热恒温水浴锅，北京长风仪器有限公司；PHS-3B雷磁精密pH计，上海精密仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶制剂提取人参果汁的工艺路线

1) 单一酶解处理。新鲜人参果→分拣→清洗、切条→护色→打浆→调pH、温度→加酶→灭酶→压榨、过滤→澄清→人参果汁

2) 分段酶解处理。新鲜人参果→分拣→清洗、切条→护色→打浆→调pH、温度→加酶1→调pH、温度→加酶2→灭酶→压榨、过滤→澄清→人参果汁

1.2.2 酶解前处理

1) 护色处理。挑选无腐烂、无霉变的新鲜人参果，在清水中洗净，去皮，切成3 cm长的小段，用浓度为0.3% VC溶液分别浸泡10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，对比不同浸泡时间下的护色效果，以未经VC溶液浸泡的人参果作为对照组。以人参果浆液的色差值(△E)为评价指标，△E越大，表明该处理抑制果汁褐变的效果越好。

2) 打浆破碎。将经过护色处理的瓜条放入破壁机中，按料液比50∶500(g/L)进行破碎打浆得到人参果浆液，置于4℃冰箱备用。

1.2.3 单一酶解法不同因素处理人参果的出汁率 分别考察果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶不同添加量及3种酶制剂在不同温度、不同pH和不同作用时间条件下对人参果出汁率的影响。其中，混合酶由纤维素酶和半纤维素酶以1∶1的比例混合而成，下同。根据前期预试验的结果，每个处理3次重复。

1) 酶制剂用量。试验设8个处理，果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶的添加量分别为0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L、0.35 g/L、0.40 g/L和0.45 g/L，酶解温度为50℃，pH 5.0，酶解时间为45 min。

2) 温度。试验设7个处理，果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃。果胶酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分别为 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解pH5.0，酶解时间为45 min。

3) pH。试验设7个处理，果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，果胶酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分别为 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解温度为50℃，酶解时间为45 min。

4) 酶解时间。试验设8个处理，果胶酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解时间分别为25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min和60 min，设置果胶酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分别为 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解温度为50℃，酶解pH 5.0，酶解时间为45 min。

1.2.4 分段酶解法提取人参果汁的工艺优化 根据单因素试验结果，从中选取水解后出汁率较高的果胶酶和混合酶进行双酶组合分段酶解试验。设5个处理，包括试验组〔T1(果胶酶+混合酶)和T2(混合酶+果胶酶)〕及对照组〔T3(果胶酶)、T4(混合酶)和3种酶组合分段处理T5(果胶酶+混合酶+木瓜蛋白酶)〕。每个处理3次重复。

T1(果胶酶+混合酶)，取打浆后的人参果浆液，调节pH 5.0、水浴温度45℃，添加0.20 g/L果胶酶酶解35 min；保持体系pH 5.0，水浴温度升至55℃，加入0.25 g/L混合酶，水浴酶解45 min。T2(混合酶+果胶酶)：取打浆后的人参果浆液，调节pH 5.0、水浴温度55℃，添加0.25 g/L果胶酶酶解45 min；保持体系pH 5.0，水浴温度降至45℃，加0.20 g/L混合酶酶解35 min。T3(果胶酶)，取打浆后的人参果浆液，调节pH 5.0、水浴温度45℃，添加0.20 g/L果胶酶酶解80 min。T4(混合酶)，取打浆后的人参果浆液，调节pH 5.0、水浴温度55℃，添加0.25 g/L混合酶酶解80 min。T5(果胶酶+混合酶+木瓜蛋白酶)，取打浆后的人参果浆液，调节pH 5.0、水浴温度45℃，添加0.20 g/L果胶酶酶解35 min；保持体系pH 5.0，水浴温度升至55℃，添加混合酶0.25 g/L酶解45 min；再调节pH 4.0，水浴温度降至50℃，加入木瓜蛋白酶0.35 g/L酶解45 min。

1.2.5 指标测定

1) 出汁率。根据榨出的汁液重量与人参果重量的比值进行计算得出。

出汁率=榨出的汁液重量/人参果的重量×100%

2) 酶活力。果胶酶活力测定采用次碘酸钠滴定法[16]；纤维素酶活力测定采用CMC酶活法[17]；半纤维素酶活力测定采用DNS比色法[18]；木瓜蛋白酶活力测定方法参照《蛋白酶制剂》(GB/T 23527—2009)[19]进行。

1.3 数据统计与分析

试验结果均以平均值±标准差表示。采用Minitab 10.0进行单因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同浸泡时间人参果浆液的色泽

从图1看出，随浸泡时间延长，人参果浆液的色差值(△E)逐渐增大，表明延长作用时间可以有效抑制果汁的褐变现象。当浸泡时间超过30 min后，色差值变化幅度不明显。因此，确定用0.3% VC溶液浸泡护色处理的最适时间为30 min。

图1 VC溶液不同浸泡时间人参果浆液的色泽Fig.1 Color of S. muricatum juice with different soaking time in VC solution

2.2 不同水解酶的酶活力

测试结果表明，不同酶制剂的酶活力不同，其中，果胶酶的酶活力为2 000 U/g，纤维素酶/半纤维素酶混合酶为3 000 U/g，木瓜蛋白酶为2 000 U/g。

2.3 单一酶解法不同因素处理人参果的出汁率

2.3.1 酶添加量 从图2看出，随酶用量的增加，各种酶制剂处理人参果的出汁率均呈先急升后平缓趋势。果胶酶：酶添加量0.10～0.20 g/L时，人参果出汁率显著提高，从62.0%迅速增至73.6%，是由于果胶酶能破坏人参果中的果胶质，使果肉中内溶物更多释放出来，从而提高人参果出汁率。继续增加果胶酶用量，酶解作用已基本达饱和，所以出汁率增加不明显。混合酶：当混合酶添加量为0.25 g/L，人参果出汁率为75.8%，继续增加混合酶用量出汁率变化不大。木瓜蛋白酶：随木瓜蛋白酶添加量增加，人参果出汁率不断升高，当木瓜蛋白酶添加量为0.35 g/L时，人参果出汁率达72.7%，继续增加木瓜蛋白酶量，人参果出汁率变化不大。结合实际生产成本和可操作性，后续试验选择果胶酶添加量为0.20 g/L，混合酶为0.25 g/L，木瓜蛋白酶为0.35 g/L较适宜。

图2 3种酶不同添加量处理人参果的出汁率Fig.2 Juice yield of S. muricatum under three enzymes with different additive volumes

2.3.2 酶解温度 从图3看出，随着酶解温度升高各种酶处理人参果出汁率均呈先升后降趋势。果胶酶：当温度35～45℃时，酶活力逐渐增强，出汁率明显提升，当温度为45℃，出汁率最高，达78.2%。温度继续升高，出汁率反而降低。复合酶：复合酶处理出汁率的变化趋势与果胶酶的类似，其作用温度为55℃时出汁率最高，达80.0%；之后随温度升高出汁率呈下降趋势。木瓜蛋白酶：其最佳作用温度为50℃，出汁率为78.0%；温度超过50℃，出汁率快速下降。综上，果胶酶的最佳水解温度为45℃，复合酶为55℃，木瓜蛋白酶为50℃。

2.3.3 pH 从图4看出，随pH增加各种酶处理人参果的出汁率均呈先增后减趋势。果胶酶：pH 3.0～5.0时，果胶酶的活力逐渐提升，出汁率随之增大；当pH为5.0时，出汁率最高，达78.7%；pH继续升高，出汁率反而降低，是由于过高的pH使果胶酶变性失活，从而导致水解效率下降。复合酶：随pH增加复合酶处理的人参果出汁率呈上升趋势，当pH为5.0时，出汁率最高，为83.4%；之后随pH增加出汁率呈下降趋势。木瓜蛋白酶：随pH增加木瓜蛋白酶处理的人参果出汁率呈上升趋势，当pH为4.0时，出汁率最高，为79.4%；之后随pH增加出汁率呈下降趋势。综上，果胶酶和复合酶的最佳水解pH均为5.0，木瓜蛋白酶的最佳水解pH为4.0。

图4 3种酶不同酶解pH处理人参果的出汁率Fig.4 Juice yield of S. muricatum with different pH values during enzymatic hydrolysis process

2.3.4 酶解时间 从图5看出，随酶解时间增加各种酶处理人参果的出汁率呈先急升后平缓趋势。果胶酶：酶解时间25～35 min时，出汁率明显提升；当酶解时间为 35 min时，出汁率为83.6%，继续延长酶解时间，出汁率增幅缓慢，酶解时间超过45 min后出汁率略有下降。原因在于酶解时间过长，酶的活性降低，底物浓度也不断减小，从而影响人参果出汁效果。复合酶：酶解时间25～45 min时，出汁率迅速提升；当酶解时间为 45 min时，出汁率为85.0%，继续延长酶解时间出汁率增加不明显。木瓜蛋白酶：酶解时间25～45 min时，出汁率呈迅速提升趋势，木瓜蛋白酶水解时间为45 min时出汁率为82.3%；继续延长酶解时间，出汁率缓慢增加并趋于稳定。结合实际生产成本选择果胶酶的最佳酶解时间为35 min，复合酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解时间均为45 min。

图5 3种酶不同酶解时间处理人参果的出汁率Fig.5 Juice yield of S. muricatum with different enzymatic hydrolysis time

2.4 分段酶处理人参果的出汁率

从图6看出，不同处理人参果的出汁率为84.72%～94.92%，处理间存在差异，表现为T5>T1>T2>T4>T3。其中，T5分段处理的人参果出汁率最高，达94.7%，但该方法耗时过长，不利于实际生产和应用。T1的分段酶解效果其次，人参果出汁率为92.5%。因此，综合生产时间及成本等因素，选择果胶酶+混合酶的分段处理方式作为人参果汁的提取制备方法。

图6 分段酶处理人参果的出汁率Fig.6 Juice yield of S. muricatum with different different segmented enzymatic treatment patterns

3 讨论

植物细胞中，果胶质通常与纤维素以相互结合的形式存在。由于纤维素是葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键链接而成的大分子链状聚合物，性质稳定，因此与纤维素结合的果胶酶或半纤维素也难以被水解[20-21]。试验结果表明，在人参果汁制备过程中，相比于果胶酶的单一作用[7]，果胶酶协同纤维素酶和半纤维素酶使用是一种高效、节能、降低成本，并且有效提高人参果出汁率的方法。同时，采用双酶分段水解较单一酶水解明显提高人参果汁的出汁率，是由于单一酶酶解时，只能对某一类底物或者固定的酶解位点发挥作用，酶解效果受到限制，而双酶组合水解则能较好地发挥协同互补作用，提高水解效率。与杨建军等[11-15]的研究结果，即不同酶制剂组合和协同使用，可进一步增大作用范围，显著提高鲜果出汁率的研究结论一致。

4 结论

人参果由于其丰富的营养价值和保健作用，可进一步开发成高附加值的新型饮料。通过单因素试验探讨3种酶(果胶酶、混合酶和木瓜蛋白酶)单独提取人参果汁的最适酶解参数，在此基础上筛选出水解效果较好的果胶酶和混合酶进行组合酶分段酶解试验，得到制备人参果汁的最佳酶解工艺参数：果胶酶添加量0.20 g/L，温度45℃，pH 5.0，酶解35 min；然后调节pH 5.0，温度55℃，添加混合酶0.25 g/L，酶解45 min。按此方法人参果的出汁率为92.5%。果胶酶+混合酶的分段水解方式能显著提高人参果出汁率，可为提高人参果出汁率的工业化生产提供理论依据。