低分子有机酸浸提和添加锌肥、锰肥对甘草地土壤4种金属元素释放及赋存形态的影响

李振凯，马少兰，高 雪，万 依，于丽丽，梁新华

(宁夏大学生命科学学院，银川 750021)

【研究意义】甘草是宁夏的道地药材，盐池县是中国甘草之乡，其基原植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)，又名乌拉尔甘草，是豆科、甘草属多年生草本，其根与根状茎粗壮，干燥后作中药甘草入药，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效作用[1-2]。化学元素是中药发挥疗效的重要物质基础，同时其对植物正常的生长发育及有效物质积累也具有极其重要的作用[3-4]。土壤元素是中药材吸收、积累化学元素的主要来源和影响因子，并影响根系营养吸收及生理代谢活动，其中金属元素是土壤元素重要组成部分[5-6]。大量研究表明，土壤中的金属元素影响着植物光合作用、呼吸作用、新陈代谢等多项生理过程，其对植物的作用仅受元素种类和含量的影响，还与金属元素的赋存形态紧密相关[7]。因此，研究土壤中金属元素赋存形态对于指导甘草生产有着积极参考价值。【前人研究进展】甘草药材中含有多种金属元素，其中Ca、Mg、Mn随甘草生长时期变化表现出显著上升趋势[8]，研究证实叶面喷施锌肥和锰肥可不同程度提高甘草根中甘草酸、角鲨烯等有效成分含量[9]，同时Zn和Mn元素会显著影响甘草酸生物合成关键酶基因的表达[10]。药用植物生理与分子生物学课题组在前期的研究中，从甘草根系分泌物中鉴定出乳酸和草酸2种低分子有机酸[11]。石晶等[12]通过外源施用乳酸，发现以实际分泌浓度(1×10-4mol/L)乳酸外源处理甘草幼苗不同时间，GuSQS1和GubAS基因的表达量均出现不同程度的改变，在3 d的处理时间下，对甘草自身产生了一定化感自毒作用，并降低了甘草酸的含量。笔者通过外源喷施草酸、乳酸等低分子有机酸，研究不同甘草根系分泌物对甘草种植地后茬3种春小麦产量和品质的影响[13]，发现不同低分子有机酸对不同品种春小麦的产量和蛋白质、氨基酸含量产生了不同的影响。以上研究进一步验证了甘草根系分泌物中低分子有机酸对自身及其它植物的化感作用。此外，植物根系分泌物对于土壤中金属元素释放和赋存形态的研究已多有报道[14-16]。徐秀月等[17]通过模拟湿地植物根系分泌物分析其对酸性矿山废水沉淀物(AMD)中Fe、Mn释放及形态的影响，发现柠檬酸、苹果酸和草酸3种低分子有机酸对(AMD)中Fe、Mn的释放均起到了促进作用，同时不同浓度的有机酸可导致AMD沉淀物中Fe、Mn的可交换态含量升高，可还原态逐渐减少。游蕊等[18]利用室内模拟实验，分析不同浓度的柠檬酸、酒石酸和草酸溶液对三峡库区消落带土壤中汞赋存形态及其随培养时间的变化特征的影响，发现柠檬酸能提高三峡水库消落区土壤中汞的迁移性以及生物有效性，草酸和酒石酸对土壤中汞的迁移能力则表现为一定的抑制作用。张新帅等[19]研究了铅锌矿区周边玉米根系低分子量有机酸、根际土壤镉铅形态与植株镉铅累积特征，发现玉米可通过根系分泌低分子量有机酸，影响根际土壤重金属化学形态与生物有效性，进而影响植株对重金属的吸收积累。【本研究切入点】甘草根系分泌物中的低分子有机酸，以及施加锌肥和锰肥是否对甘草种植地土壤中Ca、Mg、Zn和Mn 4种金属元素释放和赋存形态产生了影响，尚未有研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以乳酸和草酸及2种低分子有机酸1∶1比例的混合酸作为提取介质，以宁夏盐池人工种植甘草(3年生)地土壤样品(以下简称土壤)为研究对象，开展上述低分子有机酸以及外源添加锌肥和锰肥对土壤中Ca、Mg、Zn和Mn的浸提效果以及赋存形态影响的研究，以期为甘草地土壤改善以及人工种植甘草质量调控提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

土壤样品采集自宁夏盐池县人工种植乌拉尔甘草(3年生)生长地，采集方法为对角线取样法，采集0～20 cm土壤样品，于阴凉、干燥、通风良好的地方自然风干，过10目样品筛，过筛后的土壤样品收集于密封塑料袋中，室温保存备用。

草酸和乳酸纯度为98%，均为分析纯试剂；锌肥为七水硫酸锌，纯度为99%；锰肥为一水硫酸锰，纯度为98%；实验用水均为去离子水。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 不同浸提介质处理 精密称取150.0 g土壤样品12份，分别置于大小一致的塑料盒(长17.0 cm，宽10.0 cm，高6.8 cm)中，全部样品随机分为4组，每组各3份，每份土壤样品加水使各组土壤样品均达到60%的田间持水量，放置室温条件下于实验室老化3周。4组样品老化完成后分别采用水(对照组)、乳酸溶液(10-4mol/L)、草酸溶液(10-4mol/L)及混合酸溶液(即10-4mol/L草酸溶液和10-4mol/L乳酸溶液等量混合)提取Ca、Mg、Zn和Mn元素。具体方法为称取12份2.00 g的土壤样品，分别置于50 mL离心管中，4组样品分别加入上述不同的提取液30 mL，于25 ℃下210 r/min振荡提取2 h，3500 r/min离心10 min，上层清液用0.45 μm的微孔滤膜过滤后，参照劳家柽[20]的方法，采用原子吸收分光光度计测定各样品液中Ca、Mg、Zn和Mn元素浓度，计算元素浸提率。下层土壤残渣样品经自然风干，磨细过100目筛，采用优化的BCR连续提取法(表1)[21]提取样品中不同形态(弱酸可溶态、可还原态、可氧化态和残渣态)的4种元素，并采用火焰原子吸收分光光度仪测定其含量。

表1 土壤Ca、Mg、Zn和Mn形态的BCR连续提取方法

1.2.2 不同施肥处理 称取150.0 g土壤样品9份，分别置于与1.2.1项下相同的塑料盒中，随机分为3组，每组各3份，分别添加2 g原土(即未处理人工种植甘草地土壤样品，对照组)、0.048 g锌肥和1.952 g原土、0.312 g锰肥和1.688 g原土处理，随后每份土壤样品加水，进行与1.2.1项下相同的老化处理。老化完成后以水为浸提液并进行1.2.1项下相同的元素释放和赋存形态检测。

1.3 数据处理

数据采用Excel对试验数据进行整理，采用SPSS 22软件进行方差分析和新复极差法(Duncan)[12]多重比较，采用Origin 2018软件及Hiplot科研数据高级可视化平台进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同浸提介质对土壤中4种金属元素的浸提效果

从表2可知，草酸、乳酸及混合酸浸提相较水均有效提高了4种元素的浸提效率。其中乳酸和混合酸浸提Ca元素效果显著高于草酸又显著高于水浸提，以乳酸效果最为优异；浸提Mg元素效果上，草酸、乳酸及混合酸效果相近，且均达到显著提升效果；此外混合酸对Zn和Mn元素的浸提效果最好，显著优于草酸、乳酸和水，水的浸提效果最差，草酸和乳酸浸提Mn元素效果相较水浸提虽未达到显著水平，但依旧提高了浸提效果。综上，不同有机酸均可有效提高Ca、Mg、Zn和Mn元素的提取效率，但是因元素不同浸提效果表现出一定的特异性。

表2 不同提取介质对壤4种元素浸提效果

2.2 外源添加锰肥和锌肥土壤中4种金属元素浸提效果

从表3可知，外源添加锰肥后，相较于无添加显著提高了Mn元素的浸提含量，是添加原土的7倍，同时显著提高了Mg、Ca和Zn元素的浸提效果，尤其是对Ca和Mg元素，分别提高了8.6和6.7倍。外源添加锌肥后显著提高了Zn元素的浸提含量，为无添加的41.5倍，同时也显著提高了Ca和Mg元素的浸提效果，为添加原土的2.9和4.2倍。可见添加锰肥和锌肥后不仅对土壤中相应的Mn和Zn元素的浸提效果产生了显著影响，其相互间以及对其它元素的浸提效果都会产生影响。

表3 不同外源添加土壤4种元素浸提效果

2.3 不同浸提介质对土壤中4种金属元素化学形态的影响

2.3.1 Ca元素形态 采用BCR连续提取法结合火焰原子吸收分光光度仪对土壤中Ca、Mg、Zn和Mn元素的4种元素形态的含量进行测定，通过分析人工种植甘草地土壤中4种金属元素的量比关系确定结构比，并比较不同有机酸介质浸提后对金属元素形态占比的影响。土壤中Ca元素(图1-A)以可还原态和弱酸可溶态为主，占比分别为39.09%和32.53%，其次为可氧化态26.99%，残渣态占比最低，为1.39%；采用低分子有机酸浸提后，混合酸和乳酸均显著提高了可还原态的占比，其中混合酸效果最明显，占比达到41.73%，同时2种酸显著降低了可氧化态的占比，分别为24.39%和24.29%，草酸对2种元素形态均未产生显著的影响。此外，3种有机酸介质对Ca元素残渣态和弱酸可溶态均未产生显著影响。综上，未经低分子有机酸浸提的人工种植甘草地土壤中Ca元素4种形态量结构比为：m(弱酸可溶态)∶m(可还原态)∶m(可氧化态)∶m(残渣态)=1.00∶1.20∶0.83∶0.40；不同低分子有机酸浸提后，主要影响了土壤中Ca元素的可还原态和可氧化态占比，以混合酸和乳酸的影响最为明显，且2种元素形态呈现出由可氧化态占比逐渐降低，还原态逐渐上升的趋势。

A、B、C和D依次为Ca、Mg、Zn和Mn元素形态占比。图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同A, B, C and D show the percentages of Ca, Mg, Zn and Mn elements in morphological order. Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same as below图1 不同提取介质土壤Ca、Mg、Zn和Mn元素形态占比Fig.1 Soil morphological ratio of Ca，Mg，Zn，and Mn elements in different extraction media

2.3.2 Mg元素形态 对照组土壤中Mg元素(图1-B)残渣态占比最高，为65.21%，其次为可氧化态和弱酸可溶态，分别占比15.17%和12.14%，可还原态占比最低，为7.49%。经低分子有机酸浸提后，均有效提高了Mg元素弱酸可溶态、可还原态和可氧化态占比，同时显著提高了残渣态的占比，其中乳酸对弱酸可溶态的占比影响最大，混合酸对可还原态占比影响最大，此外3种有机酸对Mg元素产生了相近的降低可氧化态占比和提高残渣态占比的作用。综上，未经低分子有机酸浸提的人工种植甘草地土壤中Mg元素的结构比为∶m(弱酸可溶态)∶m(可还原态)∶m(可氧化态)∶m(残渣态)=1.00∶0.62∶1.25∶5.37；而不同有机酸对Mg元素的形态产生了较大的影响，且4种元素形态均产生了显著的变化，总体表现为残渣态不断降低，另外3种形态占比逐渐上升的趋势，其中已草酸的影响最为突出。

2.3.3 Zn元素形态 对照组土壤中Zn元素(图1-C)形态以残渣态占比最高，为86.12%，其次为可氧化态和可还原态，占比分别为7.44%和6.24%，弱酸可溶性态占比最低，为0.20%。3种低分子有机酸均显著提高了弱酸可溶态占比，其中混合酸影响最大，相较对照组提高3.53倍，其次为乳酸和草酸；草酸和混合酸提高Zn元素可还原态占比作用最显著；草酸还显著提高了Zn元素可氧化态占比，混合酸也有一定的提高可氧化态占比作用；同时草酸和混合酸均显著降低了Zn元素残渣态的占比；此外，乳酸也具有一定的提高Zn可还原态占比和减低残渣态占比的效果，但均未达到显著水平。综上，未经低分子有机酸浸提的人工种植甘草地土壤中Zn元素的结构比为∶m(弱酸可溶态)∶m(可还原态)∶m(可氧化态)∶m(残渣态)=1.00∶31.20∶37.20∶430.60；不同有机酸对土壤中Zn元素的不同形态产生了不同影响，草酸和混合酸的影响较明显，其中Zn元素残渣态逐渐降低，另外3种形态占比逐渐升高，而乳酸则主要作用于弱酸可溶态，对其它元素形态影响较弱。

2.3.4 Mn元素形态 对照组土壤中Mn元素(图1-D)弱酸可溶态占比最大，为55.83%，其次为残渣态和可氧化态，分别占比34.75%和7.56%，可还原态占比最低，为1.86%。在低分子有机酸浸提下，乳酸和混合酸显著提高了可溶态占比，草酸亦具有一定的提高作用，但未达到显著水平；此外，3种有机酸均显著降低了可还原态、残渣态和可氧化态的占比，其中以草酸和混合酸降低可还原态、残渣态占比最为突出。综上，人工种植甘草地土壤中Mn元素的结构比为：m(弱酸可溶态)∶m(可还原态)∶m(可氧化态)∶m(残渣态)=1.00∶0.30∶0.14∶0.62；3种有机酸对Mn元素的影响表现为残渣态、可氧化态和可还原态占比逐渐上升，弱酸可溶态逐渐升高的趋势，其中以乳酸的作用效果最为明显。

2.4 外源添加锰肥和锌肥对土壤中4种金属元素化学形态的影响

从图2可知，外源添加锰肥后，显著提高了土壤中Mn元素的可氧化态、可还原态和弱酸可溶态，可见施加锰肥主要影响以上3种Mn元素形态，而对残渣态的影响较小，同时因可氧化态、可还原态和弱酸可溶态占比的提升，残渣态的占比显著降低。此外，外源添加锰肥还显著提高了土壤中Ca元素的可氧化态、弱酸可溶态和残渣态占比，降低了可还原态占比；显著提高了Mg元素的残渣态占比，降低了弱酸可溶态和可还原态占比；显著提高了Zn元素的弱酸可溶态，可还原态和可氧化态占比，降低了残渣态占比。

外源添加锌肥后，显著提高了土壤中Zn元素的可氧化态、可还原态和弱酸可溶态，而残渣态则显著降低，其特征与锰肥对Mn元素形态的影响一致。

外源添加锌肥同锰肥一样显著提高了土壤中Ca元素的可氧化态、弱酸可溶态和残渣态占比，降低了可还原态占比；显著降低了Mg元素的弱酸可溶态和可氧化态占比；同时显著提高了Mn元素的弱酸可溶态占比，降低了残渣态占比。综上，外源添加锰肥和锌肥不仅对土壤4种元素的浸提效果产生了影响，对土壤中4种元素的形态也产生了不同程度的影响。

2.5 土壤中Ca、Mg、Zn和Mn元素形态相关性分析

为了进一步分析不同元素形态间是否存在相互作用关系，利用Origin 2018软件对不同处理下4种金属元素的4种元素形态进行相关性分析，并以显著性值小于0.05(P<0.05)为阈值，绘制不同元素及形态相关性热图(图3)。同一元素间，Ca元素的残渣态与可氧化态呈显著正相关，可氧化态与弱酸可溶态和可还原态、残渣态与可还原态呈显著负相关；Mg元素残渣态与弱酸可溶态和可还原态呈显著负相关；Zn元素的弱酸可溶态、可还原态和可氧化态互呈显著正相关，同时与残渣态呈显著负相关；Mn元素中可氧化态与可还原态呈显著正相关，同一元素中具有显著正相关的形态可能存在一定的协同关系，或在有机酸浸提及外源添加影响下表现出相同的变化规律，而显著负相关性的形态可能存在一定的拮抗或相互转化关系。不同元素中Ca和Zn元素与其他元素的不同形态均无显著相关；Mg元素的弱酸可溶态与Mn元素的残渣态呈显著正相关，与Mn可还原态为显著负相关，同时Mg可氧化态与Mn弱酸可溶态、Mg残渣态与Mn残渣态亦呈显著负相关，推测2种元素的不同形态间可能存在一定相互作用关系或相同的响应规律。

图中“×”标记为在P<0.05水平下不具有显著性，无该标记为具有显著性The marker ‘×’ in the figure is not significant at the P <0.05 level， and none is significant图3 Ca、Mg、Zn和Mn元素形态相关性Fig.3 Morphological correlation of the Ca, Mg, Zn and Mn elements

3 讨 论

除金属元素总量外，赋存形态是影响土壤金属元素的生物有效性以及金属元素在土壤—植物体系迁移富集作用的重要因素[25]。赋存形态的不同，其活性和对生物的有效性亦不同[26]。BCR 方法将金属元素的形态划分为弱酸可溶态(可交换态)、可还原态、可氧化态和残渣态，其中弱酸可溶态活性最高，易被植物吸收利用；可还原态活性也较高，pH<7 条件下易水解，具有一定的生物有效性；可氧化态的活性较弱，需在强氧化条件下释放；残渣态是最稳定的状态，其活性低且难以进入环境[27]。在本研究中人工种植甘草地土壤中Ca、Mg、Zn和Mn元素的4种形态具有不同的结构比和特征，Ca元素以可还原态和弱酸可溶态为主，Mg和Zn元素以残渣态为主，Mn元素则以弱酸可溶态为主。不同有机酸浸提后，在有效提升4种重金属元素释放量的同时，对土壤中的金属元素形态占比也产生了不同程度的影响。其中Ca、Zn和Mn元素在有机酸浸提情况下，土壤元素形态的占比均呈现为由活性低向活性高的形态转化的趋势，表现出优异的活化效果。而Mg元素在释放量显著提升的情况下，其活性高的弱酸可溶态、可还原态和可氧化态显著降低，但最大占比、活性最低的残渣态占比却不断上升，说明相较其它3种金属元素，Mg元素残渣态更加稳定，不易向有效态转变，因此活化的难度更大。这可能是造成目前土壤中Mg元素消耗严重，而植物缺镁现象越来越严重的又一原因，值得关注和进一步的验证，同时在甘草种植过程中要注意Mg元素的补充和缺素症的防控。

外源添加肥料等物质是目前田间管理过程中重要的技术措施之一，其可以有效改善土壤环境、补充和提高土壤肥力、促进农作物生长等[28]。在本研究中，通过施加锰肥和锌肥，显著提高了土壤中2种金属元素的释放量，并有效提高了土壤中弱酸可溶态、可还原态和可氧化态的占比，验证了2种肥料促进元素释放和活化、改善土壤的作用。施加2种肥料除对自身元素的影响外，对其它金属元素的释放和元素形态占比也有不同程度的影响，可能与土壤中离子代换作用有关。笔者进一步对4种金属元素的4种形态进行相关性分析显示，除了同一金属元素中不同形态具有不同的相关性外，元素间不同形态也存在不同程度的相关性，尤其是Mn与Mg元素的多个形态间存在显著正、负相关性。可见4种土壤的金属元素及形态之间可能存在相互作用，这可能与土壤中复杂的络合反应、螯合反应、氧化还原反应等有关。

根系分泌物是植物通过溢泌作用释放到土壤中的低分子可溶性物质[29]，其可以起到活化土壤中矿质营养的作用，进而提高土壤中可利用的营养含量，促进周围植物更好地生长[30]，而低分子有机酸则是根系分泌物的主要成分之一。甘草作为深根系的植物和根类药材甘草的基原植物，其生长发育及有效物质积累与包括金属元素在内的土壤环境息息相关。本研究在药用植物生理与分子生物学课题组前期从甘草根系分泌物中鉴定到草酸和乳酸2种低分子有机酸，以及发现了金属元素影响甘草生长发育和有效物质积累的研究基础上，分析2种低分子有机酸以及外源添加锌肥和锰肥对人工种植甘草地土壤中4种金属元素释放及形态的影响，证实了2种低分子有机酸活化4种金属元素的作用，验证了外源添加锌肥和锰肥的作用效果，发现金属元素间可能存在的相互作用，而土壤中金属元素赋存形态的变化对甘草植物生长发育的影响，本课题组将在此基础上进一步开展科学研究。综上，研究为甘草种植地土壤改良修复、甘草科学规范化种植以及通过外源合理添加低分子有机酸、肥料等物质，控制药材质量提供了一定的参考。

4 结 论

(1)低分子有机酸浸提以及外源添加锌肥和锰肥均不同程度地提高了4种金属元素的浸提效果，有利于土壤元素的释放。

(2)人工种植甘草地土壤中Ca元素以可还原态和弱酸可溶态为主，Mg和Zn元素以残渣态为主，Mn元素则以弱酸可溶态为主，经不同低分子有机酸浸提及添加锌肥和锰肥后，4种金属元素的不同形态产生了不同水平的显著变化，除低分子有机酸浸提后Mg元素残渣态升高外，总体表现为活化土壤中4种金属元素的趋势。

(3)4种金属元素的不同形态间具有不同水平的相关性，除同一金属元素中不同形态表现为不同程度的显著相关性外，元素间不同形态也表现出不同程度的相关性，以Mn与Mg元素的多个形态间最为显著。