光能变价离子钛对3种马铃薯致病菌的抑制作用

肖秋菊，唐 雪，谭 晓，肖星月，童丽颖，邵欢欢，陶 向，雍 彬

(四川师范大学生命科学学院，成都 610101)

【研究意义】马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大作物，其种植面积和产量仅次于水稻、小麦和玉米，全球消费量仅次于水稻和小麦。作为世界上马铃薯种植面积最大国家之一[1-2]，中国近年已将马铃薯列为主粮，该作物的安全生产事关国家粮食安全。马铃薯生产实践中多采用块茎营养繁殖，但营养繁殖会造成致病菌代代相传并不断积累，目前已报道的马铃薯病害有100多种，每年因病害减产10%～30%，严重时减产超过70%。由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引发的晚疫病是一种全世界范围内绝大多数马铃薯种植区均有发生的最具毁灭性的病害，曾造成1845—1950年间的爱尔兰大饥荒[3-5]，疮痂链霉菌(Streptomycesscabiei)、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)等也会对马铃薯安全生产造成严重威胁，茄科雷尔氏菌造成的青枯病是马铃薯生产中的第二大病害[6-7]。马铃薯疮痂病是一种世界性土传病害，可由S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies、S.galilacus等多种链霉菌引发[8-9]。这3种病害均对马铃薯安全生产造成严重威胁，有效防控病害是保障马铃薯产量及质量的重要途径。长期以来马铃薯病害防控主要依靠喷施农药，加上我国农业基础设施建设落后，农民安全用药意识薄弱，大量使用化学农药与化学肥料，造成严重的农残超标、土壤残留、病原菌抗药性增强和生态环境破坏等问题，环境友好型抑菌农药的研制极为迫切。为此，我国在农业“十三五”规划中明确提出化学肥料和农药“双减”目标，推动农业可持续发展和食品安全生产。靶向马铃薯病害的化学农药替代品的研发与应用可为保障我国农业绿色生产及实现国家“双减”目标提供产品和技术支撑。【前人研究进展】钛(Titanium，Ti)是一种过渡金属元素，在地壳中的含量超过0.6%，在生物体、水体中亦广泛存在[10]。钛具有“亲生物”特性，对人体无害，是WHO唯一允许植入人体的金属。已有研究证明，钛能刺激人体内吞噬细胞提升机体免疫力，并具有一定抑菌能力[11-12]。近年来，已将钛应用于农业生产中，并证明钛能提高植物体内多种酶的活性[13-14]，促进植物对养分的吸收和利用[15]。焦浈等[16]在烟草种子中注入低剂量的钛离子，发现种子的发芽率以及叶片中的钾含量均有提升。钛除了对农作物的产量品质、生长发育产生积极的影响之外，在病虫害防治方面也发挥着重要作用。钛可有效抑制黄瓜霜霉病菌、白粉病菌、番茄和玫瑰的细菌性叶斑病菌的生长[17-19]。然而，自然界中的钛元素常以氧化物、硅酸盐结合态或钛铁矿等形式存在，难以为植物利用[20]。而离子状态的钛通常是钛与卤素生成的易挥发高价钛卤化物，且存在不稳定、遇水易发生反应等问题。光能变价离子钛(Titanium ion of variable valence with light energy，TIVL)中的钛是一种稳定的新型钛离子制剂[专利：US8308840B2；20151077 3354.4]，其中的钛元素以离子(Ti4+与Ti3+)形式存在，于环境友好。已有田间试验显示低浓度的TIVL可以提高光合作用效率、提高作物产量与品质，使大豆籽粒中的蛋白质含量和产量分别增加1.61%和16.34%[21]，显著提升烟叶的香气、口感等[22]；低浓度的TIVL还可防止低温冷害显著提高牧草、烟草等植物种子的发芽率、促进植株根系生长[23]；另外TIVL能降低作物发病率与发病症状，李洪浩等[24]通过田间试验发现使用TIVL(675 mL/hm2)对马铃薯晚疫病的防效可达40%以上。据此推测TIVL具有抑制马铃薯致病菌生长的功能。【本研究切入点】拟于培养基中加入不同浓度的TIVL培养致病疫霉、茄科雷尔氏菌和疮痂病链霉菌3种马铃薯致病菌，分析TIVL对3种致病菌的影响。【拟解决的关键问题】明确TIVL是否具有抑制马铃薯病原菌生长的作用，寻找适宜的TIVL抑菌浓度，为TIVL应用于马铃薯病害防控领域提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

光能变价离子钛(TIVL)采购于钛谷(天津)科技有限公司，该制剂未添加其他金属元素，钛离子浓度为4 mg/mL。致病疫霉菌(P.infestans)由四川省农业科学院植物保护研究所提供，疮痂链霉菌(CGMCC 4.1765)、茄科雷尔氏菌(CGMCC 1.2839)于中国普通微生物保藏管理中心购买。

1.2 培养基制备

1.2.1 疮痂链霉菌培养基(SP-2培养基) 称取酵母提取物4.0 g，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，以蒸馏水定容1.0 L并调节pH至7.3(固体培养基加琼脂粉15.0 g)，115 ℃高压灭菌35 min。

1.2.2 茄科雷尔氏菌培养基(营养肉汁培养基) 称取蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，以蒸馏水定容1.0 L并调节pH至7.0(固体培养基加琼脂粉15.0 g)，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2.3 致病疫霉菌培养基(黑麦培养基) 称取黑麦10 g加入100 mL水中，121 ℃高压灭菌40 min，4层纱布过滤去除残渣，于上清液中加入2 g蔗糖和1.5 g琼脂粉定容至100 mL，121 ℃再次高压灭菌20 min。

1.3 供试菌种活化

将4 ℃冰箱保存的疮痂链霉菌和茄科雷尔氏菌分别划线接种至固体SP-2和营养肉汁培养基，置于28和30 ℃培养，待长出单菌落后备用。从4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麦平板切取直径5 mm的菌饼接种到黑麦培养基中央，18 ℃黑暗培养5～7 d。

1.4 菌液浓度选择

挑取疮痂链霉菌和茄科雷尔氏菌单菌落于1 mL无菌水中，以移液器吹打使之分散均匀，记为103倍稀释菌液；依次吸取100 μL菌液加入900 μL无菌水中，吹打均匀，梯度稀释至1010倍。分别取每个稀释梯度下的菌液100 μL均匀涂布于固体SP-2或营养肉汁培养基，置于28和30 ℃培养至长出单菌落，选择可清晰统计单菌落数量的梯度稀释菌液作为最适稀释浓度用于后续试验。

1.5 平板抑菌实验

固体培养基经高压灭菌后冷却至50 ℃左右，分别添加浓度为4 mg/mL的TIVL母液，使TIVL浓度为0、4、8、16 mg/L，轻轻摇匀后倒平板。

挑取疮痂链霉菌单菌落于1 mL无菌水中，经梯度稀释并涂布于SP-2培养基，发现1010倍稀释菌液培养60 h后可清晰统计单菌落数量，因此选择1010倍稀释菌液用于后续实验。

挑取茄科雷尔氏菌单菌落于1 mL无菌水中，经梯度稀释并涂布于营养肉汁平板培养基，发现茄科雷尔氏菌单菌落稀释1010倍后，涂布于营养肉汁平板培养3～4 d能清晰统计单菌落数量，因此选择1010倍稀释菌液用于后续实验。分别取最适稀释浓度的疮痂链霉菌和茄科雷尔氏菌各100 μL均匀涂布于含不同浓度TIVL的固体培养基上，置于相应温度条件下培养(疮痂链霉菌28 ℃培养60 h，培茄科雷尔氏菌30 ℃培养108 h)，于不同时间拍照记录菌落生长情况。

从4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麦平板切取直径5 mm的菌饼，接种到含有不同浓度TIVL的黑麦平板中央，18 ℃黑暗培养5～7 d，拍照记录致病疫霉菌圈生长情况。以田间生产中常用的马铃薯晚疫病防治农药福帅得(氟啶胺500 g/L，日本石原产业株式会社)对致病疫霉的抑制效果作为对照，分析TIVL的抑菌效果：黑麦培养基中加入稀释1000倍(0.5 g/L氟啶胺)和500倍(1.0 g/L氟啶胺)的福帅得，并切取5 mm直径的菌饼置于平板中央，18 ℃黑暗培养7 d，拍照记录致病疫霉菌圈生长情况。

1.6 透射电子显微镜样品制备与观察

将含有8 mg/L TIVL的致病疫霉固体培养基上生长的致病疫霉的菌丝轻轻刮下，置于1.5 mL尖底EP管内。菌丝体积不小于米粒大小，沿管壁加入由Sorensen缓冲液配置的5%的戊二醛固定液，不冲散菌丝，于4 ℃冰箱内固定过夜，0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗3次，置入1%锇酸后固定1.5 h，磷酸缓冲液漂洗3次，经50%、70%、80%、90%乙醇逐级脱水(每次15 min)，90%丙酮脱水15 min，再经100%丙酮脱水3次(每次15 min)，Embed 812树脂渗透并包埋，60 ℃高温聚合24 h后修块，采用超薄切片机(徕卡UC7)切片，经2%醋酸双氧铀染色液——柠檬酸铅染色液双重染色法染色(各25 min，每种染色剂染色后均用蒸馏水漂洗数次)，晾干，置于Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电镜观察。

2 结果与分析

2.1 TIVL对致病疫霉菌的抑制作用

切取致病疫霉菌饼接种至含有不同浓度TIVL的黑麦培养基上，培养第5天时，0 mg/L TIVL平板上致病疫霉已有较好的长势，而4和8 mg/L TIVL的平板上致病疫霉菌才开始生长，且长势较弱，16 mg/L TIVL平板上未见病菌生长迹象(图1)。经测量，培养5 d时0、4、8 mg/L TIVL黑麦平板上菌圈直径分别为(3.77±0.06)、(3.67±0.12)和(3.13±0.15)cm；培养6 d时菌圈直径分别为(4.83±0.15)、(4.60±0.10)和(4.03±0.15)cm；培养第7天时菌圈直径达到(6.40±0.10)、(6.17±0.06)和(5.20±0.36)cm(表1)。16 mg/L TIVL黑麦平板直至第7天时仍未见菌圈。添加了福帅得的黑麦培养基培养第7天时同样未见明显的致病疫霉菌圈形成。表明TIVL可显著抑制致病疫霉的生长，当TIVL浓度达到16 mg/L时，抑菌效果与福帅得相当。

图1 不同浓度TIVL与Fluazinam对致病疫霉生长的影响Fig.1 Effect of different TIVL and fluazinam concentrations on the growth of Phytophthora infestans

表1 不同浓度TIVL对3种病原菌的菌落数和菌圈直径的影响

2.2 TIVL对疮痂链霉菌的抑制作用

将疮痂链霉菌涂布在含有不同TIVL浓度的平板上，其生长状况如图2所示，培养36 h时，含0和4 mg/L TIVL的培养基上疮痂链霉菌生长趋势差别较小，分别含有(217±23)、(221±24)个菌落；含8 mg/L TIVL的培养基上菌落则明显少于0和4 mg/L的TIVL平板，只有(165±17)个单菌落；而含16 mg/L TIVL的培养基上则未见单菌落长出(表1)。培养48 h时，0和4 mg/L TIVL平板上部分单菌落已出现“融合”现象，而8 mg/L的平板上仍可清晰分辨单菌落，菌落数分别为(375±31)、(227±15)和(174±19)个(表1)。培养60 h时，8 mg/L的平板上亦出现单菌落的融合，而16 mg/L TIVL平板上仍未见单菌落长出，表明TIVL可显著抑制疮痂链霉菌的生长。

图2 不同浓度TIVL对疮痂链霉菌生长的影响Fig.2 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Streptomyces scabiei

2.3 TIVL对茄科雷尔氏菌的抑制作用

将茄科雷尔氏菌涂布于含有不同TIVL浓度的平板上观察菌落生长情况(图3)。培养36 h时，0 mg/L的TIVL平板上有菌落(690±40)个，4和8 mg/L TIVL浓度下均未见明显菌落；培养60 h时，0 mg/L的TIVL平板上长出(678±26)个单菌落，4 mg/L TIVL浓度下有菌落(323±31)个，而8 mg/L TIVL平板上单菌落数仍为0个；84 h时，8 mg/L浓度下亦可见菌落长出，数量为(76±7)个，但明显少于0 mg/L[(704±21)个]和4 mg/L[(329±9)个]；108 h时，3种TIVL浓度下的菌落数分别为(554±38)、(359±15)、(204±6)个。表明TIVL可显著抑制茄科雷尔氏菌的生长。

图3 不同浓度TIVL对茄科雷尔氏菌生长的影响Fig.3 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Ralstonia solanacearum

2.4 TIVL对致病疫霉影响的显微特征观察

以透射电镜观察含8 mg/L TIVL的培养基培养致病疫霉菌，在2000倍放大倍数下可见加入8 mg/L TIVL黑麦平板培养的致病疫霉菌体的形态、大小均发生改变，多数菌体变得不规则(图4-A，4-D)；放大至25 000倍时，可观察到菌丝的细胞质发生收缩，液泡变大(图4-B，4-E)；在50 000倍放大倍数下，可见致病疫霉细胞质和周质内出现较多黑点(图4-C，4-F)。上述结果表明TIVL的抑菌作用可能因为钛离子进入细胞内并破坏细胞结构。

A、D.放大2000倍；B、E.放大25 000倍；C、F.放大50 000倍A, D.2000 times magnification; B, E.25 000 times magnification; C, F.50 000 times magnification图4 TIVL对致病疫霉细胞结构的影响Fig.4 Effect of TIVL on the cellular structure of Phytophthora infestans

3 讨 论

作为WHO唯一允许植入人体的金属，钛在农业领域具有较好的应用前景。近年来，已有研究证明钛不仅具有一定的促生作用[13-15]，在作物病害防控方面也能发挥作用[17-19]。本研究所用的TIVL中钛以离子形式存在，相比自然存在的氧化物、硅酸盐结合态或钛铁矿形式，易于被植物吸收利用。已有的研究表明TIVL同样具有较好的促生和抑菌作用[21-24]，但目前尚未见TIVL抑制马铃薯致病菌生长的报道。本研究以含有4、8、16 mg/L的TIVL的培养基培养致病疫霉、疮痂链霉菌、茄科雷尔氏菌3种马铃薯病原菌，发现16 mg/L的TIVL完全抑制3种病原菌的生长。其中16 mg/L TIVL对致病疫霉的抑菌效果与马铃薯大田生产中常用的农药福帅得(有效成分氟啶胺)的抑菌效果相当：固体培养基培养5～7 d，无菌圈长出。针对马铃薯疮痂病和青枯病病原菌，含16 mg/L TIVL的固体培养基分别培养60和108 h，均未见单菌落。范延芬等[25]曾以不同浓度TIVL的固体营养肉汁培养基培养茄科雷尔氏菌，同样发现16 mg/L TIVL对茄科雷尔氏菌有显著的抑菌作用。但范延芬等所用茄科雷尔氏菌分离自黄瓜青枯病株，该菌株能否引发马铃薯青枯病尚不得而知。因此，本研究选用能引发马铃薯青枯病的茄科雷尔氏菌为材料，通过抑菌实验证明TIVL浓度越大对马铃薯青枯病病原菌的生长的抑制效果越明显，浓度达到16 mg/L时完全抑制病菌的生长，说明TIVL能有效抑制马铃薯病原菌，具有作为农用杀菌剂在田间生产中推广应用的前景。

抑菌剂通常是通过破坏细胞壁、细胞膜等细胞结构或干扰新陈代谢而达到抑菌效果。TIVL作为一种新型农用制剂，其抑菌机理鲜见报道。但TiO2抑菌相关研究已取得一定进展：TiO2具有光催化活性，可催化产生O2-及·OH等活性自由基，在溶液中O2-可与2分子·OH产生的H2O2反应，生成·OH、OH-与O2，而·OH 与O2可将有机质氧化成CO2与H2O，这种氧化能力可破坏微生物细胞膜导致细胞破裂，从而达到抑菌效果[26-28]。TIVL中的钛以Ti4+与Ti3+形式存在，接收光能后钛可在三价和四价之间发生价位跳跃，产生活性自由基，形成强氧化能力。因此推测TIVL对致病疫霉、茄科雷尔氏菌和疮痂链霉菌的抑菌作用机理可能与TiO2相似。杨薇薇等[29]在假单胞菌中添加钛离子后通过透射电子显微镜图可观察到细胞质和周质内均有黑点产生，通过EDS对纳米粒子分析证明黑点为钛粒子。在本研究中以含有TIVL的培养基培养的致病疫霉胞内亦有黑点出现，表明钛离子已进入到致病疫霉胞内，并在胞内通过氧化还原反应对细胞结构造成破坏，发挥抑菌作用。

4 结 论

TIVL对致病疫霉、茄科雷尔氏菌和疮痂病链霉菌3种马铃薯致病菌均有较好的抑菌作用，当TIVL 浓度达到16 mg/L时3种供试菌株已完全不能生长。TIVL进入致病菌胞内，通过氧化还原反应破坏细胞超微结构，抑制病菌正常生长，实现抑菌作用。本研究可为马铃薯绿色生产和实现化学肥料与化学农药“双减”目标提供产品和技术支撑。