沙柳SpsNAC034基因克隆及多种逆境表达分析

杨海峰,张新乾,于兴旺,郝 璞,樊俐娇,王树森,于凤强,阿拉腾苏和

(1.内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010000;2.内蒙古蒙草生态环境(集团)股份有限公司，呼和浩特 010000;3.内蒙古农业大学沙漠治理学院, 呼和浩特 010000;4.鄂尔多斯林业和草原事业发展中心，内蒙古 鄂尔多斯 017000;5.鄂尔多斯造林总场，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

【研究意义】植物在生长过程中，因为所处环境不同而遭受各种胁迫，继而影响植物正常生长发育，使林木经济产量降低，影响农业可持续发展。研究表明，NAC 转录因子可通过参与植物激素信号通路来调节植物的逆境响应。但目前对于木本植物NAC基因的抗逆研究虽有一定了解但相对滞后，因此，开展沙柳NAC转录因子的抗逆研究，探究该基因在非生物胁迫下的应答分析，将有助于进一步增加木本植物NAC转录因子的分子抗逆机制研究，对于分析沙柳NAC基因功能以及探究其抗逆分子机制具有重要应用价值。【前人研究进展】NAC是植物细胞内特有的转录因子，也是迄今为止植物基因组中发现的最大转录因子家族之一[1]。NAC转录因子包含5个典型的NAC子结构域：A、B、C、D和E，由大约150个氨基酸组成[2-3]。NAC转录因子的命名最初源于被发现含有NAC结构域的3个同源基因的首字母，即在胚胎和花朵发育中起作用的矮牵牛无顶端分生组织中克隆出来的NAM基因、ATAF1/2以及在拟南芥中克隆得到的CUC2(对于杯状子叶)基因[4-5]。伴随着基因组学的快速发展，目前对NAC转录因子的研究也已逐步深入。在拟南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh. (Cruciferae)]、水稻(OryzasativaL.)、玉米[ZeamaysL. (Gramineae)]、大豆[Glycinemax(Linn.) Merr. (Leguminosae)]、番茄[LycopersiconesculentumMill. (Solanaceae)]、菠萝[Ananascomosus(Linn.) Merr.]、柑橘[CitrusreticulataBlanco (Rutaceae)]、沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Leguminosae)]、小黑杨[Populus×xiaoheiT. S. Hwang et Liang (Salicaceae)]、柳树(苏柳)等植物中均证实了NAC转录因子的存在和功能。研究发现，苏柳中SlNAC1、SlNAC2基因分别可被干旱、盐诱导，且表达量均上调[6]。NAC7基因已在小黑杨中成功克隆，主要在根中表达并且对盐胁迫有响应[7]。在水稻和拟南芥基因组中，成功预测了149和106个NAC家族转录因子，这些NAC转录因子对植物生长发育均具有重要的调控作用[8-9]。Jeong等[10]研究发现，水稻中过量表达Os11g03300/OsNAC10的植株在生殖阶段对干旱具有较强的耐受性，表明这2个NAC基因对干旱胁迫具有重要作用。脱落酸(Abscisic Acid)ABA处理过后的少数OsNAC基因属于SNAC亚组和NAM/CUC3亚组，并在叶片和穗中产生应答反应[11]。此外，Ooka等[12]发现NAM和CUC2都参与茎顶端分生组织的形成和发育，而且还在NAM和NAC1亚组中发现了预测的其它NAC蛋白。上述研究说明NAC转录因子不仅在植物的抗逆中具有重要功能，而且也参与了植物的形态建成和发育。【本研究切入点】我国西部地区是典型的盐碱地沙质土壤，维持其植物多样性以及生态系统稳定是重中之重。荒漠植物沙柳(SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang) 在长期的进化过程中，对环境的适应和抵抗能力逐渐增强。沙柳的根系发达、发芽势强[13]，是少数能在盐碱地生长的植物之一，维持其稳定的生物量至关重要。因此，本研究以沙柳为实验材料，对沙柳NAC转录因子进行同源克隆、生物信息学分析以及抗逆机制的研究具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究以沙柳为研究对象，克隆沙柳SpsNAC034基因的编码序列(Coding Sequence, CDS)，进行生物信息学分析，并通过模拟非生物胁迫揭示该基因在沙柳经高温、低温、盐以及干旱4种逆境后的响应特性，为探究沙柳的抗逆育种提供应用依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

该研究使用的实验材料沙柳(SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang)是来自内蒙古鄂尔多斯达拉特旗吉格斯太镇的沙柳种质资源库的无性系，截取长势良好植株水培备用。

1.2 实验方法

1.2.1 沙柳总RNA的提取及反转录cDNA的合成 使用天根RNAprep Pure Polysugar Polyphenol Plant Total RNA Extraction Kit总RNA 提取试剂盒(DP441)提取沙柳总RNA，反转录(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)合成cDNA，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 UTR区设计特异性引物及基因克隆 利用拟南芥NAC基因与欧洲红皮柳和毛果杨进行同源比对分析之后，再用Primer 5.0软件在基因UTR区设计特异性引物NAC034-F1(TTATTCGAGGCGGTCCGA)、NAC034-F2(GGAGTTGGAGTTCAAGTCTTCA AG)，送中美泰和生物公司合成。

以cDNA为模板进行PCR扩增，最佳退火温度60 ℃。反应体系20 μL: cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，A8高保真酶(2×A8 Fast HiFi PCR MasterMix)10 μL，蒸馏水补至20 μL。反应程序：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性1 min， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃再延伸5 min后将所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪显示其与目的基因条带一致后用Takara凝胶回收试剂盒回收目的基因。利用胶回收所得目的片段连接克隆载体(pEASY-Blunt zero Cloning Vector)后转化感受态细胞。待含有相应抗生素的固体LB板长出单菌落后，挑取单菌落通过PCR检测目标条带正确后送全式金生物公司测序。

1.2.3 沙柳SpsNAC034基因生物信息学分析 利用在线网站NCBI 的 ORF分析SpsNAC034基因的开放阅读框；同源氨基酸序列用Phytozome 11数据库查询；分别通过T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)、MEME Suite(http://meme-suite.org/)进行氨基酸多序列以及结构域的比对; MEGA 6.0和ClustalX 2.0构建进化树; ExPASy和ExPASy-ProtParam tool分析SpsNAC034氨基酸的理化特性，包括总平均疏水指数、原子量、分子量、理论等电点、蛋白质不稳定指数等; 利用在线网址(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)和Singal P4.1查询确定SpsNAC034蛋白是否存在信号肽、跨膜结构；将SpsNAC034基因的蛋白序列上传至NPS(@https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)、Swiss model(http://swiss model.expasy.org/)分析蛋白质二三级结构；通过WOLF PSORT(http: //www.genscript.com/wolf-psort.html)进行亚细胞定位的分析预测[14-15]。BAR(http://bar.utoronto.ca)杨树基因数据库在线预测基因的组织特异表达情况[16]。

1.2.4 沙柳SpsNAC034基因组织特异性表达RT-PCR分析 利用1.2.1以上提取的RNA的多糖多酚试剂盒提取沙柳各组织部位(根、叶、花、嫩茎、成熟茎、嫩芽)的RNA，并反转录获得cDNA。再利用1.2.2克隆所得的SpsNAC034基因的CDS序列通过Primer3.0设计特异性定量引物qNAC034-F1(CTCTGATTCGGCTGATCCTC)和qNAC034-R1(TTC ATCCGTAGGACGAAACC)，送中美泰和生物公司合成。以cDNA为模板，UBQ(UBQ_F-AAGCCCAAG AAGATCAAGCA和 UBQ_R-ACCACCAGCCTTCTGGTAAA)为内参，利用实时荧光定量PCR分析SpsNAC034基因在沙柳不同组织部位基因的相对表达量。根据公式2-ΔΔCt分析实验数据，再通过SPSS(Statistical Product and Service Solutions)软件进行显著性分析。

1.2.5 沙柳SpsNAC034基因非生物胁迫处理下的定量表达分析 选取水培处理后长势良好的嫩枝，将其分别置于20%聚乙二醇6000 (PEG-6000)和250 mmol/L NaCl溶液中于25 ℃培养箱中模拟干旱和盐胁迫，蒸馏水处理作为对照(CK)，同样置于25 ℃培养箱。为了探究温度胁迫对基因表达量的影响，将其分别置于低温(4 ℃)和高温(40 ℃)培养箱中模拟温度胁迫。以上处理均提供14 h光照，10 h黑暗进行试验培养。分别于胁迫处理1、2、3、4、6、8、12、24、48 h后，采集不同处理下包括对照组的叶片，每种处理的样品随机采集并混样，3次生物学重复。采样后置于液氮中保存备用。

2 结果与分析

2.1 SpsNAC034基因克隆

以所提沙柳的RNA反转录获得的cDNA为模板，SpsNAC034-F1和SpsNAC034-R1为特异性引物进行目标序列克隆。电泳结果显示目的序列长度与目标条带一致(图1)。测序后获得长1797 bp的编码序列(Coding Sequence, CDS)，编码598个氨基酸(图2)。

M:Trans2K DNA Marker；SpsNAC034: SpsNAC034克隆片段M: Trans2K DNA Marker; SpsNAC034: SpsNAC034 clone fragment图1 目的基因扩增检测Fig.1 Target gene amplification detection

图2 SpsNAC034基因CDS及蛋白序列Fig.2 CDS and protein sequence of SpsNAC034 gene

2.2 SpsNAC034基因的生物信息学分析

2.2.1SpsNAC034基因的氨基酸同源序列比对分析 将SpsNAC034基因与欧洲红皮柳(SapurV1A.0003s0310.1)、毛果杨(Potri.002G182400.1)、拟南芥(AT4G35580.1)、葡萄(GSVIVT01027470001)、木薯(Manes.05G014800.1)、水稻(LOC_Os06g01230.1)、高粱(Sobic.001G290400.1)编码的同源氨基酸序列进行多序列比对分析(图3)。SpsNAC034基因与以上同源氨基酸序列均具有典型的保守结构域NAM，在线网址Pfam显示SpsNAC034氨基酸序列150～279(C～E区域)为NAM结构域。且对比分析以上氨基酸序列发现NAM结构域的序列相对保守，上述预测发现的典型NAM结构域特征，表明本研究克隆基因隶属NAC转录因子家族。

a: 同源氨基酸多序列比对；b: 同源结构域比对a: Homologous amino acid multiple sequence alignment; b: Homologous domain alignment图3 SpsNAC034基因氨基酸多序列比对和同源结构域比对Fig.3 Amino acid multiple sequence alignment and homology domain alignment of SpsNAC034 gene

利用MEME Suite将SpsNAC034基因与以上植物的氨基酸同源序列进行同源结构域的分析比对，表明上述同源序列既存在相似结构域，也存在一定的差异结构域(图3)。由图3-a的同源氨基酸多序列比对和图3-b的同源结构域比对可知，SpsNAC034基因与以上同源序列均具有C、D、E 3个同源区域，该区域主要为NAM结构域，具有较强保守性；但也存在较大的差异区域，其中A、B、F、G、H、I区域为木本植物与草本植物的差异区域，表明可能木本和草本植物存在分化差异，尤其是A、B区域为沙柳和欧洲红皮柳特有的结构域，其他物种不具有，表明这可能是柳属分化的一个特征区域。

2.2.2SpsNAC034基因的系统进化树构建 将 SpsNAC034氨基酸序列和其他物种的同源序列构建进化树。表明，SpsNAC034基因的系统进化树共分为木本植物和草本植物两个大类。木本植物聚为一个大类，其中SpsNAC034基因与欧洲红皮柳、毛果杨的NAC034基因[17]聚为一类；草本植物聚为另一个大类，将同为禾本科以及单子叶植物的高粱和水稻聚为一亚类，其它草本植物各为一亚类。表明，杨柳科植物的NAC034同源基因的亲缘关系更密切，与草本植物同源基因的亲缘关系较远。推测NAC034基因在木本和草木本植物间存在一定的分化，该结果与上述氨基酸同源序列分析的结果一致。

2.2.3 SpsNAC034氨基酸的理化特性分析 SpsNAC034蛋白在第183个氨基酸处疏水性最强，最大值达3.056，第225个氨基酸处亲水性最强，最小值达-3.078，总平均疏水指数(GRAVY)达到-0.510，属于亲水性蛋白。其蛋白分子式为C2866H4478N788O928S31，总原子量9091，分子量65 815.66 kDa，理论等电点(pI)5.32，在氨基酸成分中，丝氨酸(Ser)的含量最高，为14.0%。SpsNAC034蛋白携带正、负电荷氨基酸残基(Arg+Lys、Asp+Glu)总数分别为50和73。 预测结果显示蛋白质半衰期是30 h，不稳定指数为56.83，将其归类为不稳定的蛋白质。

图4 SpsNAC034 基因系统进化树Fig.4 SpsNAC034 gene phylogenetic tree

图5 SpsNAC034蛋白亲水疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of SpsNAC034 protein

同时，psNAC034蛋白没有跨膜结构和信号肽。

2.2.4 SpsNAC034蛋白二级、三级结构预测 在线预测SpsNAC034蛋白的二级蛋白结构(图6)发现，其主要包括延伸链(Extended strand)、α螺旋(Alpha helix)以及无规则卷曲(Random coil)，分别占18.73%、16.72%、64.55%。无规则卷曲为主要结构，α螺旋占比最小，其中N端二级结构主要以延伸链为主， C端以无规则卷曲为主要结构。

蓝色：α螺旋；紫色：无规则卷曲；红色:延伸链 Blue: Alpha helix;Purple: Random coil;Red: Extended strand图6 SpsNAC034蛋白的二级结构Fig.6 Secondary structure of SpsNAC034 protein

通过SWISS-MODEL预测SpsNAC034蛋白的三级结构(图7)，预测结果显示GMQE(全局模型质量评估)为0.13，覆盖率为0.26；SpsNAC034蛋白与3ulx.1.A的相似度最高，3ulx.1.A为应激诱导转录因子 NAC1，是水稻处于逆境时响应 NAC1 保守结构域的晶体结构，SpsNAC034蛋白与其相似度达到40%，表明SpsNAC034 蛋白与NAC1很可能存在一定的功能相似性。

图7 SpsNAC034蛋白的三级结构Fig.7 Tertiary structure of SpsNAC034 protein

2.2.5 亚细胞定位预测 根据亚细胞定位软件WOLF PSORT对SpsNAC034蛋白进行亚细胞定位(表1)。鉴于它位于细胞核 (NUC) 中，准确率为 85%，对该蛋白的初步分析其可能在细胞核中起作用。

表1 SpsNAC034亚细胞定位

2.3 SpsNAC034基因的组织特异性表达预测与定量表达分析

根据杨树基因组在线表达分析数据库BAR，以SpsNAC034基因在毛果杨中的同源基因Potri.002G182400.1为依据进行检索，预测其在杨树不同组织内的表达特异性(图8)。从预测结果推测，SpsNAC034基因在花中相对表达量最高，在韧皮部、叶和根中均少量表达，其他部位表达不明显。

图8 SpsNAC034表达量预测Fig.8 SpsNAC034 expression prediction

通过RT-PCR检测分析SpsNAC034基因在沙柳各组织部位的相对表达量，NAC034基因在花中的相对表达量最高，其次在成熟茎、叶片、根以及嫩芽中的表达量依次降低(图9)。此结果与上述杨树基因数据库BAR在线预测SpsNAC034基因表达特异性一致。推测SpsNAC034基因在不同组织中相对表达量存在差异可能是由于该基因对沙柳不同组织发育或抗逆的生理调控有关。

不同小写字母代表P<0.05水平差异显著Different lowercase letters represent significant differences at the level of P<0.05图9 SpsNAC034基因在不同组织部位的相对表达Fig.9 Relative expression of SpsNAC034 gene in different tissues

2.4 SpsNAC034基因非生物胁迫处理下的定量表达分析

从图10可知，经高温、低温、盐以及干旱胁迫处理，SpsNAC034基因均有响应。其中经低温和高温胁迫后，基因表达量迅速积累，其表达水平分别在1和2 h处达到高峰，随后下降，基本与对照组维持在同一水平；盐处理后，前8 h其基因表达相对稳定，而在8 h之后其表达量开始逐渐增高，并在48 h处达到最高; PEG模拟干旱条件下，其表达水平迅速增加，在1 h时达到峰值，之后缓慢下降，维持在较低水平。表明SpsNAC034基因在低温、高温、盐和干旱胁迫下均显著上调，说明该基因在非生物胁迫下有显著响应，其可能在对这些环境刺激的反应中发挥一定作用。

*代表P<0.05水平差异显著* represents a significant difference at the level of P<0.05图10 SpsNAC034基因在不同逆境下的相对表达量Fig.10 Relative expression of SpsNAC034 gene under different adversities

3 讨 论

本研究将SpsNAC034基因与其同源序列进行氨基酸多序列及结构域比对、进化树聚类分析，结果表明沙柳的NAC034基因与木本植物间NAC034基因的相似度较高，与草本植物间存在一定差异，造成此差别的原因可能是由于木本和草本在漫长的进化过程中对不断变化的环境适应的结果。全基因组重复(WGD)又称多倍化(Polyploid)，使染色体数目加倍，导致数百数千个重复基因被保留，并最终影响物种多样化[18]。WGD存在于多种真核生物的进化历程中，程强等[19]通过分析杨树基因组内8000个旁系同源基因，推测杨树在进化过程中截至目前至少经历了3次基因组重复事件。研究发现毛果杨和小叶杨都存在WGD事件[20]； WGD 扩展了众多杨树基因家族[21]；由此推测可能是由于杨树基因组重复事件致使木本和草本植物的基因序列呈现差异，而且在漫长的进化过程中，导致基因的多态性增加，基因结构不断发生变异，从而使草本和木本植物的同源NAC034基因之间的差异不断增大，进而形成不同的基因结构，最终可能导致功能出现一定的分化。本研究中进化树以及同源结构域比对结果同样印证了NAC034基因结构在木本和草本植物间的差异。

沙柳NAC034基因响应多种非生物胁迫。研究发现沙柳经高温和低温胁迫后，NAC034基因分别在1和2 h表达上调，而后降至对照组水平，表明低温和高温均可诱导SpsNAC034基因的迅速表达，且该基因在温度胁迫仅1和2 h呈现高表达，这表明其很可能是在温度胁迫下促使基因表达的早期重要调控因子。盐和干旱胁迫也诱导SpsNAC034基因的高表达。本研究分别在盐处理8 h以及干旱处理1 h后，SpsNAC034表达均有明显上调，只是在应答快慢上有所差异。上述研究表明，沙柳NAC034基因响应了多种非生物胁迫。在其他相关物种研究中，NAC基因也响应了多种非生物胁迫。柑橘CsNAC基因在低温、干旱、盐胁迫下，其表达水平均上调[22]，鹰嘴豆CarNAC1、CarNAC5基因分别在低温和高温胁迫下均可被诱导表达，且表达量显著增加[23-24]；硬粒小麦经高温和干旱、盐处理后，TaNAC69-1基因均显著表达，分别在24和48 h达到峰值[25]; 菠萝NAC转录因子基因AcoNAC1经低温、干旱处理后分别在24和12 h表达量最高[26]。研究发现，拟南芥中ANAC019、ANAC055、ANAC072基因可被干旱和盐诱导，其过量表达使转基因植株的耐旱性显著增加[27]；小麦NAC型转录因子基因TaNAC4和TaNAC8分别经盐、低温和干旱处理后，表达量均明显增强[28-29]；SNAC1[30]和SNAC2[31]基因对胁迫产生应答，在转基因水稻植株中的过表达大大增强了其耐旱和耐盐性。辣椒的CaNAC61基因经盐、干旱、高温等处理后表达量均显著上调[32]。本研究的SpsNAC034基因同样对多种非生物胁迫有响应，表明该基因参与了沙柳的多种非生物胁迫应答反应，对增加植物的抗逆育种具有重要应用价值。

4 结 论

本研究获得了具有NAC基因家族典型结构域的沙柳SpsNAC034基因，隶属NAC基因家族；该基因在木本和草本植物间存在一定的分化；在沙柳中呈现组织特异性表达，花中表达量最高；SpsNAC034基因对多种非生物胁迫均具有应答反应。预计该基因对未来研究木本植物的抗逆调控机理具有一定参考价值，也可能对提高木本植物的抗逆性具有重要作用。