氯仿和邻苯二甲酸二辛酯联合暴露对小鼠脾脏内LDH及ATP酶的影响

王明霞 梁 虹 李吉平 陈明琪 杜琳琳

邻苯二甲酸酯类(PAEs)作为环境内分泌干扰物存在于多种环境介质中，并通过食物链逐渐累积，具有多种损害作用，如肝脏毒性、生殖毒性、免疫毒性、水生和陆生生物的生态毒性效应、神经行为发育异常、胰岛素抵抗、肥胖、哮喘和过敏性疾病、内分泌系统相关肿瘤等。邻苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate，DOP)属于优先控制的环境污染物。氯仿(chloroform，CF)能够对神经系统、心脏、肝脏、肾脏等产生损害作用，抑制农作物、水生生物生长，严重时导致中毒死亡。DOP和CF均可通过多种暴露途径进入机体，混合物所产生的毒性效应可能不同于其单一毒性，因而研究其共同暴露对机体的联合毒性影响具有重要的意义。课题组前期已就二者对小鼠脑组织、肝脏、肾脏、心肌组织等的联合毒性影响进行研究。脾脏是机体重要的免疫器官，又是发挥免疫应答和免疫效应的场所，本研究通过检测小鼠脾脏中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及ATP酶的活力，探讨DOP和CF对小鼠是否具有免疫损伤作用，对后续进一步深入研究具有借鉴意义。

材料与方法

1.主要仪器与试剂：电子天平(TLE204E)购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；低速自动平衡离心机(LDZ5-2)购自北京医用离心机厂；数显三用恒温水箱(HH-W600)购自金坛市医疗仪器厂；紫外可见分光光度计(T6)购自北京普析通用仪器有限责任公司；DOP(分析纯)购自天津市光复精细化工研究所；CF(分析纯)购自北京北化精细化学品有限公司；LDH试剂盒、ATP酶试剂盒购自南京建成生物研究所。

2.动物的分组与染毒：选择健康成年雌性昆明小鼠20只，体质量为25±2g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司[动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001]，饲养于齐齐哈尔医学院动物实验中心[使用许可：SYXK(黑)2016-001]。实验期间，小鼠正常摄食、饮水，饲养温度21～23℃，相对湿度65%，自然昼夜交替。将小鼠随机分为4组，分别为540mg/kg DOP+112mg/kg CF(DOP+CF)组、540mg/kg DOP(DOP)组、112mg/kg CF(CF)组和玉米油(对照组)，每组5只。采用等容积灌胃法(10ml/kg)，1次/天，连续染毒15天。

3.脏器系数计算：染毒结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取脏器，称量脾脏质量，计算脾脏系数(%)=脾脏质量(g)/体质量(g)×100%。

4.小鼠脾匀浆中LDH、ATP酶的测定：将脾脏组织与0.9%NaCl注射液按1∶9的比例制备成初始浓度为10%的匀浆液，以4000r/min离心10min，取上清，按照试剂盒说明书进行LDH、ATP酶检测。LDH检测时按步骤加入样本和基质缓冲液、辅酶Ⅰ，混匀后37℃孵育15min，加入2，4-二硝基苯肼，混匀后再次37℃孵育15min，加入NaOH溶液室温放置3min，440nm波长，1cm光径比色测定；ATP酶按照酶促反应→定磷→660nm波长，1cm光径，比色测定。

结 果

1.小鼠脾脏质量及脾脏系数的结果分析：各组小鼠脾脏质量及脾脏系数比较，差异均无统计学意义(分别为0.032、0.405，均>0.05)，DOP和CF联合染毒对小鼠脾脏质量、脾脏系数的影响均未见交互作用(分别为0.006、0.033，均>0.05，表1)。

2.小鼠脾脏中LDH、ATP酶的测定结果分析：各组小鼠脾脏Na-K-ATP酶活力比较，差异无统计学意义(=3.142，>0.05)，各组小鼠脾脏LDH、Ca-Mg-ATP酶活力比较，差异均有统计学意义(分别为8.000、8.585，均<0.01)。与对照组比较，CF组LDH活力升高，各染毒组Ca-Mg-ATP酶活力均降低(均<0.05)；与DOP组比较，仅CF组LDH活力升高(<0.01)；与CF组比较，DOP+CF组LDH活力降低(<0.01)。DOP和CF联合染毒对小鼠脾脏LDH、Na-K-ATP酶、Ca-Mg-ATP酶的影响未见交互作用(分别为2.532、1.191、2.261，均>0.05，表2)。

讨 论

LDH广泛分布于血流丰富的器官和细胞中，是糖酵解的关键酶，在临床诊断上有较高的敏感度，但特异性较差。LDH和ATP在机体的能量供应方面起着重要作用。

本研究中各组小鼠体质量、脾脏系数的变化比较，差异无统计学意义，可能与染毒剂量及染毒时间短有关，尚未表现出差异性，有待于进一步进行研究。各染毒组小鼠脾脏中的Ca-Mg-ATP酶活力均低于对照组，提示DOP、CF使ATP损耗多，能量大量消耗，自由基产生增加，自由基可直接作用于酶上的活性基团引起基团结构变化而使酶活性发生改变，也可引起酶蛋白周围的脂类过氧化使酶活性发生改变，导致Ca-Mg-ATP酶活性下降。对自由基与Na-K-ATP酶和Ca-Mg-ATP酶活性关系研究结果显示，细胞膜Na-K-ATP酶和Ca-Mg-ATP酶活性降低，膜脂质过氧化显著增高。自由基对Ca-Mg-ATP酶活性产生影响，使细胞内Ca排出障碍，细胞内Ca含量升高，导致组织供氧减少，从而加重脂质过氧化及自由基的损害，进一步降低了Ca-Mg-ATP酶活性。

细胞外钙内流激活蛋白激酶和磷脂酶，使机体损伤进入恶性循环，继而影响LDH等酶活性的改变，能量供应障碍，脾脏内的免疫活性物质合成与释放减少，可能导致免疫功能紊乱的发生，同时对各种感染性因素的防御能力降低。通过与对照组及DOP组比较，仅CF组小鼠脾脏LDH活力发生改变，推测可能是脾脏对CF的敏感度强于DOP。DOP和CF同时暴露后，小鼠脾脏LDH、Na-K-ATP酶、Ca-Mg-ATP酶的影响均未见交互作用。

存在的不足：①本研究仅提示了DOP和CF同时暴露可能导致机体免疫功能损伤，其具体机制尚不清楚；②本研究仅是推测可能导致Ca-Mg-ATP酶活力降低的原因和其产生的后果，未进一步探讨脂质过氧化、免疫活性物质等指标的变化；③本研究仅是针对DOP和CF暴露和非暴露水平的研究，未进行不同暴露水平的梯度实验研究。基于以上，有待于进行进一步研究。

综上所述，在本实验条件下，DOP和CF同时暴露可能导致机体免疫功能紊乱，且对小鼠脾脏LDH、ATP酶的影响未见交互作用。